İKİNCİL ENDOSİMBİYOSİS

                                   İKİNCİL ENDOSİMBİYOSİS

Erken ökaryotik evrim için klasik görüş; anaerobik evriminin bir süreci olarak, konak hücrenin aerobik çevreyi sömürgeleştirmesine izin veren mitokondriyal endosimbiyontların çekirdekli fagositik hücreler tarafından yutulmasıdır. Aynı döneme ait önceleri mitekondri içermediği düşünülen anaerobik ökaryotların da varlığı bu fikre destek olmaktadır. Ancak bu hipotezin anahtarı olan grupların, daha önce gözden kaçan mitokondriyal homologlar hidrojenozom ya da mitozom olarak adlandırılan, mitekondrilerle ortak silsilere sahip fakat aerobik solunum gerçekleştirmeyen organelleri içerdikleri gösterilmiştir. Bu verilerin ökaryotik ağacı üzerinde haritalanmasıyla, ökaryotlar arasında anaerobik habitatlara sekonder adaptasyonu gösterilmiştir. Mitokondriyal homolojinin her zaman her yerde görülmesi, belki de ökaryotların evriminin kurucusu olan mitokondriyal endosimbiyosisin önemini gösterir. Farklı mitokondriyal homolojilerin karşılaştırılması çalışmaları günümüz ökaryotların temel, birincil önemini belirtmek için gereklidir.

1-GİRİŞ

Ökaryotik oluşum için ortaya koyulan birçok klasik teori, ökaryotların önceleri mitokondri olmadan anaerobik koşullarda oluştuğunu önerir. Ökaryotik topluluğunun sonradan aerobik solunum yapan ve daha sonra endosimbiyont olarak hayatını sürdürebilen bir öbakteriyi fagosite ettiği düşünülmektedir. Bu öbakteriyal endosimbiyont aerobik kolonilerinin oluşmasına izin vermiştir. Bu fikir, günümüzde siliyat protozoonlar arasındaki modern analoglar ile desteklenir. Fakat bu iki hücrenin nasıl bir araya geldikleri ve yaşamlarını birlikte nasıl sürdürebildikleri bilinmemektedir. Dolayısıyla bu konuda çeşitli görüşler vardır. Genel görüş ise iki hücrenin ekolojik ortamda yakınlaştıkları ve seçici bir avantaj sağladıkları yönündedir. Konak-endosimbiyont birlikteliği sonucu oluşan canlı, bugün görülen tüm mitokondri içeren ökaryotların atasını oluşturmuştur. Böylece tüm mitokondrilerin ortak atası, mitokondri tarafından kodlanan genlerin filogenetik analizleriyle desteklenmiştir. Anaerobik ökaryotlar mitokondri endosimbiyosisin yokluğu nedeniyle oksijen miktarının artması ya da başka bir felaket sonucu soyları tükenmiştir ya da günümüzde aerobik koşullarda yaşamlarına devam etmektedir. Doğru olduğu diretilen bu hipotez birçok açıdan makuldür. Mikrobiyal dünyanın ekstinksiyonu, popülasyonun büyüklüğünden, dağılmanın kolaylığından ve dirençli duruma gelmesinden dolayı nadir görülür. Hatta geçici anaerobik habitantlar genellikle protist habitantlara hükmeder. Antik oksijen miktarı yükseldikçe anaerobik canlılar, aerobik canlıların etrafında düşük karbondan yararlanabilecekleri oksijenik fotosentezi türetmişlerdir. Günümüzde, oksijenik fototrofların anoksigenik ortamlar sağlamak için organik materyalleri indirgeme yeteneği sayesinde anaerobik canlıların miktarı çok fazladır. Sonuç olarak, ilkel amitokondriyal ökaryotların var olduklarını kabul edersek mitokondriyal endosimbiyosise katılmadıklarından dolayı soylarının tükendiğini ve yok olduklarını söyeleyebiliriz.

 Bu hipotez,  mitokondri bakımından eksik çağdaş ökaryotların keşfiyle desteklenmiş oldu. Archezoa olarak adlandırılan bu ökaryotlar,  primitif durumda mitokondri olmadığını ve Entamoeba, Giardia, Trichomonas ve Microsporidia'yı ve onunla yakın ilişkili türleri içeren ikincil kayıptan kaynaklanmayan bir durum olduğunu işaret eder. Mitekondri içermemesine ek olarak Archezoa'lar, onların öncül durumlarını destekler şekilde diğer ökaryotlarda ortak olarak bulunan Golgi ve peroksizom bakımından da eksiktir. Hipokondria adıyla da bilinen Archezoa erken ökaryotun evolüsyonun anlaşılması ve ilk ökaryotun gösterilmesi için model oluşturur. Archezoa'ların parasitik ya da anaerobik yaşam stillerine adaptasyonlarının Archezoa'lara özgü özelliklerinin oluşmasına neden olduğu ya da kolaylaştırdığı yönünde tahminler vardır. Fakat bu görüş kesin değildir, çünkü Archezoa ile ökaryotik gruplar arasında karşılaştırılmış kesin bir kayıt bulunmamaktadır. Ökaryotik evriminin pre-mitokondriyal fazında bir bakış sağlayabilecek ökaryot gruplarına dikkat çekmek için hazırlanmış taksonomik hipotez ile Archezoa hipotezi sitolojik benzerlik göstermektedir. Böylece bu çalışma diğer çalışmalar için kılavuz oluşturur. Moleküler dizi analizlerine dayalı ilk filogenetik ağaç oluşturulması, Archezoan'ların mitekondrili ökaryotlardan önce oluşumuna önemli destek sağlamıştır. Bu ağacın doğruluğu hakkındaki şüpheler de ortaya koyulmuştur.

2-ARCHEZOA’NIN MİRASI

Son zamanlarda Archezoa’larda bir mitekondri kalıntısının bulunmuş olmasıyla birlikte bunların endosimbiyosisten önce evrimleşmeyeceği düşüncesini oluşturmuştur. Bu nedenle mitokondri içeren ökaryotların kollara ayrılması sırasında Archezoan’ların mitokondriyal genleri içerdiği gösterilirse,  yani ağaçtaki yerleşiminin tamamen yanlış olduğu ve mitokondri içeriyor olduğu gözden kaçtığı gösterilirse,  Archezoa’ların mitokondrisiz olduğu ve ökaryot evriminde endosimbiyont olabileceği hipotezi reddedilebilir. Bu kriterlerin kullanılmasıyla en iyi çalışılmış Archezoan’ların tümü için Archezoa hipotezi şu anda reddedilmiştir. Bu gün bu veri ve deliller formüle edilmiş anahtar türler için sorgulanmaktadır ve reddedilebilir. Bu yüzden burada bu verilerin açıklamasını içine alan deliller ve çelişkiler üzerinde durulacaktır.

En çok çalışılan Archezoan’ların mitokondriyal kökenli konak hücre tarafından kodlanan genleri içerdiği gösterilmiştir. Öyle ki, mitokondri fonksiyonundan sorumlu proteinleri kodlayan genleri içerirler ve bu proteinlerin filogenetik analizleri yapıldığında alfa-protobakterilerle monofilotik olduğu gözlenir. Mitokondriyal endosimbiyont kaynağı olan bakterilerin bu grubu, mitokondriyal genom tarafından kodlanan genlerin analizine dayalıdır. Archezoa hipotezinin reddedilmesi için tablo 1'deki genler kullanılmış fakat buradaki çelişki, bunun için kullanılan genlerin hiçbirinin mitokondriyal genomda bulunmuyor olmasıdır. Oksidatif fosforilasyona katılan proteinlerin bir kısmının bulunduğu yerlerde aerobik mitokondrilerin fonksiyonları organeller ve genler arasında doğrudan bir bağlantı oluşturabilir. Konak nüklear genomdaki mitokondriyal genlerin yerleşiminin açıklanması, endosimbiyont genomundan konak genoma endosimbiyotun bir organele dönüşümü sırasında geçip geçmediğini anlamak için gereklidir. Bu süreç endosimbiyotik gen transferi olarak adlandırılmaktadır. Örneğin bitkiler arasında mitokondriyal genomlarında benzer genler görülmektedir fakat bazı soylarda bu genler konak hücrenin nukleusu tarafından kodlanır. Gen transferinin gerçekleştirilmesine ihtiyaç duyulmasına rağmen, tablo 1 de gösterilen genlerin mitokondriyal endosimbiyonttan kaynaklandığı hipotezi, muhtemelen bu verilerin standart bir açıklamasıdır.

Ayrıca Archezoan’ların tablo 1'deki farklı endosimbiyontlardan elde edilmiş genleri içerebileceği de öne sürülmüştür.  Bu fikirler, yukarıda bahsedilen standart yoruma güvenilir bir alternatif olarak sunulmuş olsa da, bu Archezoa genlerinin filogenetik analizlerinin kesin bir kanıtı yoktur. Çift katlı organellerde bulunan tablo 1’deki bakteriyal proteinleriyle yapılan araştırmalar sonucu bu proteinlerin Archezoan’ların önceleri mitokondrisiz olmadığı konusunda kuvvetli kanıtlar oluşturmaktadır. Ökaryotlarda tartışmasız prokaryot kökenli çift membranlı organeller olan mitokondri ve plastidler vardır. Tipik olarak mitokondrilerde bulunan bu proteinlerin çift zarla çevrili Archezoan organellerinde de bulunmasını, bu organellerin mitokondri ile ortak soydan gelmeleriyle açıklayan bu hipotez, basit ve bu nedenle tercih edilendir. Mitokondri, mitozom ve hidrogenozomlar evrimsel açıdan homologlardır ve aralarındaki farklılık ortak bir atasal organelin modifikasyonlarından kaynaklanır. Mitokondri, mitozom ve hidrojenozomları homolog kabul eden bu hipotez eğer bu organellerle daha derinden çalışılırsa ve ek olarak aralarındaki benzerlikler de ortaya çıkarılırsa desteklenmiş olur. Şu ana kadar olan da budur.

Dikkate değer bir şekilde hidrojenozom ve mitozomlar genom olarak eksiktirler, muhtemelen bunun nedeni oksidatif fosforilasyon için kodlanan proteinlere uzun süre ihtiyaç duymamalarıdır. Hidrojenozom ve mitozomda fonksiyon olan proteinler sitozolde sentezlenip daha sonra doğrudan organele taşınıyor olmalıdır. Mitokondriler genom içermelerine rağmen ihtiyaç duyduğu proteinlerin çoğu konak hücrenin nukleusu tarafından kodlanır, bu nedenle burada da proteinlerin taşınması için benzer bir mekanizma söz konusudur. Mitokondrilerde protein transportu için iki ana mekanizma geliştirilmiştir.

Mitokondriyal iç membrana yönlendirilen proteinler internal hedef sinyalleriyle yönlendirilirler. Mitokondriyal matrikse yönlendirilecek proteinler amino terminallerinde hedef diziyi taşıyan öncü proteinler olarak sentezlenirler ve mitokondrilere bu proteinlerin geçişi sırasında bu hedef diziler kesilirler. Proteinlerin taşınmasını sağlayan bu sistemlerin geliştirilmesi muhtemelen mitokondri evrimindeki ilk ve en kritik adımdır.

Trichomonas vaginalis’in hidrojenozomu da protein transportu için bu iki yolu kullanır. T. vaginalis’ in hidrojenozomlarından izole edilmiş ferrodoksin, maya mitekondrilerinde bulunan ferrodoksin gibi N terminalinde hedef dizi taşırlar. Ayrıca hidrojenozomları ATP ve ADP transportunu yapan mitokondriyal taşıyıcı ailesi (MCF)’nin bir üyesini de taşır. MCF’nin üyeleri ökaryotik proteinlerdir ve iner mitokondriyal membrana internal hedef sinyalleri ile yönlendirilirler. Burada ADP ve ATP yapımıyla subsratların içeri ya da dışarı taşınmasını gerçekleştirirler.  

Bir ATP/ADP taşıyıcısının öncül mitokondri membranına insersiyonu, onun bir organele taşınmasının anahtar adımıdır. Çünkü böylece simbiyont tarafından oluşturulan ATP konak hücre tarafından kullanılabilir duruma gelir.

Yapılan heterolog transfeksiyon deneylerinde Trichomonas ADP ve ATP taşıyıcıları doğrudan maya mitokondrilerine yönlenmiştir. Buradan yola çıkarak, bu hedef sinyallerinin maya ve Trichomonas’te korunmuş olabileceği öne sürülmüştür

Trichomonas hidrojenozomları mitokondrilere özgü diğer özelliklere de sahiptir. Apoproteinlerin enzimatik kurulumlarını ve merkezlerine Fe-S’ün bağlanmasını aynı enzimlerle gerçekleştirir. Bu enzimler maya mitokondrilerde olduğu gibi mitokondriyal endosibiyonttan miras kalan enzimlerdir. Trichomonas hidrojenozomları aynı zamanda mitokondriyal solunum zincirinin birimi olan NADH dehidrogenaz da içerir. Bu verilerin geleneksel filogenetik yöntemleriyle analizleri zor olsa da, Trichomonas ve mitokondriyal proteinlerin ortak bir atadan geldiklerinin reddedilemeyeceğini takdir edilmelidir. Ayrıca aminoasit dizilerindeki farklılıklar gibi bu verilerdeki belirgin problemlerin azaltılması için düzeltme yapıldığında, oluşturulan ağaçlar bu mitokondriyal orijine destek verir. NADH dehidrojenazın keşfi uzun süreden beri sorulan hidrojenozomların malik asit oksidasyonundan sonra NAD⁺’yı yeniden nasıl sağladığı sorusuna cevap olmuştur.

Entamoeba mitozomları ADP ve ATP trasportunu gerçekleştiren mitokondriyal taşıyıcılar içerir ve bunlar heterolog transfeksiyon denyelerinde mayanın inner mitokondriyal membranında da transloke olmuştur. Tipik mitokondriyal ATP/ADP taşıyıcılarının aksine Entamoeba ATP taşınması için mitokondri positif dış membran potansiyeline ihtiyaç duymaz. Entamoeba’nın bu potansiyeli yapmak için gerekli elektron transport zincirinden yoksul olduğu gösterilmiştir.

            Giardia mitozomlarında ve mitokondride taşınma yolları da korunmuştur. Örneğin N terminal öncül dizileri, yeşil fluoresan işaretli ferrodoksinin memeli mitekondrilerine yönlendirilmesi için hem önemli hem de yeterlidir. Mikrospordiya mitozomları ile yapılan çalışmalar sonucunda mitokondriyal çalışmalarının gerisinde kalmıştır. Çünkü Mikrospordiya’lar zorunlu hüçre içi parazitleridir ve burada Entamoeba, Giardia ve Trichomonas’da olduğu gibi homolog transfeksiyon metodları yoktur. Bununla birlikte mikrosporidian Encephalitozoon cuniculi'nin yayınlanmış genomu varsayılan ortak fonksiyonlar için ipuçları sağlar. Örneğin; Encephalitozoon cuniculi'nin mitozom ve mitekondrileri arasındaki Fe–S'in bir araya gelmesini sağlayan mekanizmaların homolog olması.

Model Arkezoan’ların moleküler dizisi sıklıkla karşılaştırılan bu diğer ökaryotlara farklı şekilde evrimleştir. Fakat filogenetik analizlerin çoğu homolog prosesler olarak kabul edilir. Yani tüm bu diziler aynı yolla evrimleştiler. Bu nedenle Arkezoan dizilerinin anormal davranışları filogenetik pozisyonlarının güvenilir bir şekilde anlaşılmasını zorlaştırmaktadır. Karşılaşılabilecek bu problemlere bir örnek de; Trichomonas hidrojenozomal NADH dehidrojenaz'ın orijinini bulmaya çalışırken yaşanan zorluklardır. Elde edilen birçok veri ve analizler, Mikrosprodiaların dallanmış ökaryotlar yerine mantarlara dâhil edilmesi gerektiğini ifade eder. Entamoeba'nın mitokondri içeren aerobik bir amip olan Dictyostelium ile ilişkili olduğu hipotezi, içerdikleri protein sayısı ile desteklenmektedir. Giardia ve Trichomonas'ın ağaçtaki yerleri kesin değildir.

3- CRYPTOSPORIDIUM’DA MİTEKONDRİ BAKİYELERİ

Cryptosporidium parvum sıtma parasiti Plasmodium ile ilişkili apikompleksan bir parazittir ve ikisi birlikte apikompleksanları içine alan çoğunluğu oluşturan ökaryotlara dahildir. Cryptosporidium parvum kalıntı ya da dejenere mitokondri olarak adlandırılan çift membranlı organeller içerir. Bu organel bilinen özelliklerinden dolayı rahatça mitozom olarak adlandırılabilir. Cryptosporidium mitekondrisi genomunu ve oksidatif fosforilasyon yapma yeteneğini kaybetmiştir fakat hala heatshock proteinlerinin ifadesini gerçekleştirir. Fe-S demeti yaptığına dair kanıtlar vardır fakat bu enzimlerin in situ lokalizasyonları gösterilememiştir.

4-HİDROJENOZOMLAR: HİDROJEN YAPAN MİTEKONDRİLER

Hidrojenozomlar gerçekte sığır parasiti T.vaginalis ile yakından ilişkili Tritrichomonas'da keşfedilmiştir. Ayrıca anaerobik kitrit fungilerde ve silli protozoonların (hayvansal protistler) birçoğunda da bulunmuş. Siliyatlar içinde mitokondri- ve hidrojenozom- içeren gruplar kolaylıkla birbirlerine karışabilirler, bu pre-dominant aerobik grup içinde en az 4 belki de daha fazla hidrojenozom içeren siliyat soyları vardır. Mitokondrinin hidrojenozoma dönüşümü, mitokondri içeren Cyclidium glaucoma ve hidrojenozom içeren Cyclidium porcatum'un da dâhil olduğu Cyclidium türlerinde nispeten gösterildiği gibi kısa genetik mesafelerde oluşabilir. Siliyatların hidrojenozoma evrim geçirdiği göz önüne alınırsa, hidrojenozom ve mitozomların ortak atası için güçlü kanıtın bu gruptan geleceği belki de kaçınılmazdır. Anaerobik siliyat Nyctotherusovalis'in hidrojenozomu, mitokondriyal genomu içerir ve uzun zamandır aranan iki organel arasındaki bağlantıyı verir. Trichomonas’lar gibi anaerobik mantar Neocallimastix de genom eksikliği göstermektedir. Ayrıca Neocallimastix genomlarında MCF’lerin üyelerini de içermektedir. Bu proteinler in vitroda ADP ve ATP transportunu yaptıkları gösterilmiştir. Daha önemlisi, ADP/ATP taşıyıcıları bakımından mutant maya mitokondrilerinde bu yeteneklerini yeniden kazanmasını sağlar. Böylece mantar hidrojenozomları ve maya mitokondrileri ADP/ATP taşınması için aynı yolları kullandıkları ve ilgili proteinlerin taşımasını aynı yolla gerçekleştirdiği gösterilmiştir. Neocallimastix hidrojenozomları ayrıca Cpn60 ve Hsp70 mitokondriyal proteinlerini ve bu proteinlerin yönlendirilmesi için gerekli hedefleme sinyallerini ya da memeli mitokondrilerinde yeşil fluoresan reporter proteinlerini taşır. Anaerobik ökaryotik çeşitliliği başarısız organel fonksiyonlarından kaynaklanır. Bu nedenle bu grupların hidrojenozom içerdiği gösterilen ökaryotların dahil olduğu listeye ekleneceği kuşkuludur. Mitokondrilerin hidrojenozomlara dönüşümü, birçok tanımlanmış ökaryot çeşitliliğinin nasıl arttığı sorusuna cevap gibi görünüyor.

5-HİDROJEN YAPAN ENZİMLERİN EVRİMSEL ORİJİNİ

Hidrojenozomlar hidrojen yapabilme yetenekleriyle bilinirler ve bunu yapabilecek biyokimyaya sahiptirler. Bu da; mitokondrilerin hidrojenozomlara dönüşümünün anahtar noktasıdır. Bu organeller ATP üretiminde bir anahtar metabolik merkez olarak hizmet görür. Hidrogenozom ismi, protozoonların bu organel ile metabolizma esnasında, bir gaz halinde serbest moleküler H₂ meydana getirdiklerinin gözlemlenmesinden kaynaklanır. H₂ gazı, metabolik yoldaki terminal bir noktada H⁺ (Hidronyum) iyonlarının moleküler H₂‘e indirgenmesiyle meydana getirilir. Bu reaksiyonu katalizleyen enzim anaerobik prokaryotlardan bilinen [Fe]-Hidrogenaz (Hidrojen:Ferrodoksin Oksidoredüktaz) enzimidir. Glikolizisten türevlenen piruvat. mitokondrilerde bulunan bu reaksiyonu katalizleyen enzimden farklı olan ve yine anaerobik prokaryotlarda bulunan, kısaca PFO (Piruvat:Ferrodoksin Oksidoredüktaz) adı verilen  enzimlerdir. Ferrodoksin oldukları belirlenen ve primitif elektron taşıma bileşiği olarak kabul edilen bir Fe-S proteini tarafından yakalanırlar. İndirgenmiş taşıyıcı ise elektronları, moleküler hidrojeni meydana getirmek üzere H⁺‘lara verir ve yeniden yükseltgenir. Yani burada elektron akışı ferrodoksinden [Fe]-Hidrogenaz’a doğrudur. Aerobik şartlarda ise O₂, elektron taşıyıcı proteini yeniden okside etmek için kullanılır ve H₂ oluşumu engellenir. H₂ üretimi Trichomonas’da, piruvat-ferrodoksin oksidoredüktaz’ın aktivitesi sonucunda oluşur. Bu verilerle uyumlu olarak anaerobik siliyat ve fungi hidrojenozomlarında da bu enzimler taşınır. Fakat zıt olarak, aerobik ökaryotlar, piruvat mekanizması için bu enzimlerle nonhomolog piruvat dehidrogenaz enzimi taşırlar ve mitokondrilerinde bulunan bu enzim piruvatı dekarboksiller. Elektronlar da elektron transport zinciri yardımıyla hidrojene değil oksijene aktarılır.

            Aeorobik bakterilerin tipik enzimleri olan [Fe]-Hidrogenaz ve PFO’ların hidrojenozomlarda bulunuşu, daha önce de belirtilmiş olan Trichomonas hidrojenozomlarının bir endosimbiyotik bakteriden kaynaklandığı tartışmasını hatırlatır. Fakat ne [Fe]-Hidrogenaz ne de PFO’lar yalnızca hidrojenozomlarda bulunmazlar. Bu nedenle organellerin orijinlerinin gösterilmesi için kesin bir kanıt oluşturmazlar. Euglena mitokondrileri C-terminalinde NADPH-sitokrom P450 redüktaz domeni bağlı PFO taşıyan bir füzyon proteini olan piruvat: NADP oksidoredüktaz taşır. Aynı füzyon proteini C.parvum’da da bulunmuştur. Fakat C.parvum’daki yerleşimleri bilinmemektedir. PFO’ların geniş bir kısmı ayrıca Saccharomy cescerevisiae’da da bulunmuştur ve bunların diğer redoks proteineri ile birlikte metiyonin sentezine katıldıkları görülmüştür. PFO ayrıca Entamoeba, Giordia ve Giordia ile yakın ilişkili Spironucleus’da bulunmuş fakat bu proteinlerin yerleşimleri gösterilememiştir.

            Hidrojenozom genomları ayrıca T.vaginalis’den, N.ovalis ve Trimyema sp. siliyatından, Neocallimastix frontalis L2 ve Piromyces sp.E2 fungilerinden klonlanmıştır. Bu genlerin hepsi öbakterilerde bulunup arkebakterilerde bulunmayan [Fe]-Hidrogenazın bir tipini kodlar. Chlorella fusca, Chlamydomonas reinhardtii ve Scenedesmus obliquus  gibi yeşil alglerin kroloplastlarında  bulunan [Fe]-Hidrogenazın kullanılmasıyla hidrojen sentezi gerçekleştirilir. Plastidlerin atası olan siyanobakterilerin hidrojen yapımı için nonhomolog [NiFe]-Hidrogenazı kullandığı düşünülecek olursa, bu yeşil alglerde [Fe]-Hidrogenazın bulunması şaşırtıcıdır. Siyanobakteri orjinli olmayan konak nukleusunun kodladığı [Fe]-hidrojenazlarının yerini orjinal endosimbiyot [NiFe]- hidrojenazlar almış gibi görünüyor.

            Giardia, Spinonucleus ve Entamoebo histolytica’da da bulunmuş Trichomanos enzimleri ile [Fe]-Hidrogenazı kodlayan genlerin yapısında benzerlik gözlenir. Fakat henüz bu enzimlerin intrasellüler yerleşimleri bilinmemektedir. Giardia hidrojenin küçük bir miktarını yapabilir. Bunun eliminasyonu redoks dengesinin bu türlerde sürdürülmesine yardım eder. Entamoebo ve Spinonucleus genom yapılarının Giardia genlerinin biriyle yakın benzerlik göstermesi bu türlerin de hidrojen yapabileceğini işaret eder.

            En şaşırtıcı olanı ise [Fe]-hidrojenaz proteinleriyle ilişkili kısa protein kodlayan genlerin insanlarda da bulunmasıdır. Bu genler NARF benzeri olarak adlandırılırlar. İnsanda bu proteinlerin nukleus yapısının sürdürülmesi için gerekli lamin proteinlerinin yapımında yer aldığı düşünülüyor. Fakat homolog maya Nar1p proteinleri ile yapılan çalışmalar bu proteinlerin başka bir rol aldığını ileri sürer. Laminlerin bloke edildiği mayalarda, ekstramitokondriyal Fe-S proteinlerinin sentezinin gerçekleştirildiği sitosolde Nar1p esansiyel bir protein olarak gözlenir. Yapılan tüm çalışmalar NARF-benzeri genlerinin, genomu henüz açıklanmış en küçük genomlu intraselluler mikrospor parasiti E. Cuniculi’den itibaren tüm ökaryotlarda bulunduğunu göstermektedir. [Fe]-hidrojenazın, tüm ökaryotlarda önemli rol oynayan NARF-benzeri proteinlerin bir şekli olduğu mümkün gibi görünmektedir.

            PFO ve [Fe]-Hidrojenaz genlerinin probakterilerde ortak olduğu gibi mitokondriyal endosimbiyonttan orijinlendiği tahmin edilmektedir. Filogenetik analizler bu hipotez için bir kanıt oluşturmaktadır. Birçok ökaryotik metabolik enzimler gibi, ökaryotik PFO’lar öbakteriyal enzimlerle arkebakterilere göre yapısal olarak daha benzerdir.  Üstelik yayınlanmış PFO ile yapılmış analizler, ökaryot enzimlerinin çok eski ortak orijinleriyle tutarlı olarak ökaryotik dizileri tek bir küme halinde geri getirir. Fakat ökaryotik PFO dizileri, alfa-proteobakterilerin dizileriyle yakın değillerdir. İlginç şekilde iki alfa-proteobakteriyal diziler ağaçta aynı kümede yer almaz. Bu da, öbakteriyal PFO genlerinin evolüsyonunun tek bir kopya genin vertikal mirası ile açıklanmasından daha karmaşık olduğu fikrini oluşturur.

            Ökaryotik [Fe]-hidrojenaz dizileri arasındaki ilişki iyi bir şekilde açıklanmamıştır. Ağaçta birlikte kümelenmesine rağmen, bu veri standart testlerin kullanılmasıyla ökaryotik dizilerin erken ve ortak orijinleri için oluşturulmuş, bu hipotezi kararlı bir şekilde reddedemez.

            [Fe]-hidrojenaz içeren örnek olarak verilmiş yeşil alg ve kitrit fungileri ata kabul eden hipotezle uyumlu olarak ökaryotik dizilerin tek tek kümelendirilmesindeki tutarlılık için kuvvetli bir destek vardır. Ncytotherus ve Trimyema siliyatların birlikte kümelenmesi bir parça ilgi çekicidir. Çünkü bu morfolojik olarak farklı türler, siliyat ağacında aerobik mitekondri içermelerine göre ayrılmışlardır. Bu, [Fe]-Hidrojenaz içeren aerobik siliyatlarla ortak bir atayı paylaştığını iddia eden hipotezle uyumludur. Böylelikle, siliyatlar tarafından yapılan hidrojenozomları açıklamaya yardımcı olur. Bu ağaç ökaryotik [Fe]-hidrojenazlar ile bir alfa proteobakteriler olan Rhodopseudomonas palustris’den tek dizi arasındaki yakın ilişkisi için bir kanıt oluşturmaz. Rhodopseudomonas dizileri delta-proteobakteri üyesi olan Desulfovibrio vulgaris’ten iki farklı [Fe]-Hidrojenazdan biri ile kümelendirilir. PFO için hazırlanan ağaç gibi, prokaryotik diziler için oluşturulmuş topoloji ağacını etkileyen bir gen duplikasyonu ve/veya horizontal gen transferi olduğuna dair kanıtlar vardır. Örneğin, Desulfovibrio species [Fe]-Hidrojenazları ortak özellikleri aynı kümede yer almaları gerektiğini işaret etse de, birlikte kümelenmezler.

6- SONUÇ, SPEKÜLASYON VE TAHMİNLER

            İlkel amitokondriyal protistlerin -Archezoa- hayta olduğu fikri ilgi çekicidir çünkü mitokondriyal endosimbiyont yutmuş bir konak hücreyi, ökaryotların atası kabul eden hipoteze inandırıcılık kazandırır. Mitokondriyal orijin genlerinin ve son zamanlarda mitokondriyal homologların keşfedilmesi Archezoa’ları anahtar tür kabul eden hipotezin reddedilmesine izin verir. Bütün ökaryotların ökaryotik evülasyonunda esas rol oynayan mitokondriyal endosimbiyosisi vurgulayan bir mitokondriyal atayı organel olarak taşıması mümkün gibi gözükmektedir. Hala ökaryotik ağaç için güvenilir kaynaklara ihtiyaç duyulmasına rağmen anaerobik ökaryotların mitokondrili anaerobik gruplardan tekrar tekrar ortaya çıktı aşikardır. Anaerobik ökaryotlar nadir olmadıkları gibi aynı zamanda daha önce düşünüldüğü gibi öncül canlılar değillerdir.

            Mitokondriyal fonksiyonlarla ilgili bilinenlerin çoğu ve ökaryotik hücre için mitokondrinin önemi maya, memeli ve bitki mitokondrileri tarafından belirtilmiştir. Oksidatif fosforilasyondan başka diğer önemli reaksiyonlari kreps siklusui hem biyosentezi, yağ asitlerinin β-oksidasyonlarını, amino asit biyosentezini ve demir sülfür (Fe/S)’ün sentezi ve taşınmasını içerir. Biyokimyasal ve genomik bilgilerden anlaşılacağı gibi hidrojenozom ve mitozomlar bu fonksiyonların belli bir kısmını gerçekleştirirler. Ökaryotik hücrenin endosimbiyotik kökenli bu bölmesinin temel önemi, biyokimyasal esnekliği ve organel azaltma sınırları ile ilgili önemli soruları akla getirir. Örneğin NCF proteinlerinin çeşitliliği, mitokonriyal metabolik çeşitliliği yansıtır. Parasitik olmayan ökaryotlar tipik olarak 30 ile 60 arasında MCF genine sahiptir. Fakat. E.histolytica, mitozomlarında ADP ve ATP transportunu gerçekleştiren MCF üyeleri dışındaki tüm MCF bakımından diğerlerine göre daha fazla yoksundur. Bu da Encepholitozoon mitozomunun ATP’yi nasıl sağladığı sorusunu akla getirir.

            Sellüler hayat için gerekli olan Fe/S proteinlerine insersiyonu için Fe/S gruplarının olgunlaşması, şu ana kadar maya hücrelerine özel mitokondriler için tek biyosentetik fonksiyondur. Bu yoldaki anahtar proteinler, sistin desülfataz (IscS) ve yapı iskeleti protein( IscU) mitokondriyal endosimbiyonttan kaynaklanmış olarak karşımıza çıkar. Fe/S grubunun olgunlaşması ve tanımı mitokondriyal homologların tümü için ortak bir fonksiyon olduğu tahmin edilmektedir.

            Bu prosesin anahtar genleri incelenen tüm ökaryotik genomlarında bulunur. Fakat yalnızca Trichomonas hidrojenozomlarının ve Giardia mitozomlarının tam anlamıyla bu yolağı içerdiği gösterilmemiştir. Entamoeba IscS ve IscU mitokondriyal homogları bakımından eksiktirler ve bunun yerine Campylobacterle ilişkili bakteri tarafından horizontal gen transferi yoluyla elde ettiği NifS ve NifU homolog proteinlerini taşırlar. Bu açıdan ökaryotlar içindeki en uzak türdür. Bu yolağın varlığı tüm mitokondriyal homoglarda ortak fonksiyon olan Fe/S grubunun kurulması hipotezinin test edilmesi için esastır.

            Şu ana kadar [Fe]-hidrojenaz ve PFO genlerinin mitokondriyal endosimbiyont kaynaklı mitokondrilerin hidrojenozomlara dönüşümüne aracılık ettiğine dair bir kanıt yoktur. Fakat filogenetik analizler erken ökaryotların PFO ve [Fe]-hidrojenazı içerdiği ve hidrojen yapabildiğini ifade eder. Bu iki protein, iki ökaryot grubunun çeşitli formlarında sitosole, hidrojenozoma, mitokondriye, plastitlere ve nukleusa hedeflenmeleri araştırılmıştır. Hidrojenaz ve PFO’nun mitokondriyal bölme için özel bir afinite göstermemesine rağmen, ökaryotlar arasında yaygın olması şüphesiz ökaryotların defalarca hidrojenozom oluşturulmasına katkıda bulunur.

            Ökaryotik [Fe]-hidrojenaz ve PFO’nun orijini ayrıca ökaryot metabolizmalarının çok azında kodlanan öbakteriyal benzeri genlerin orijinin irdeleyen sorunun da bir parçasını oluşturur. Bu genleri açıklamak için bir hipotez oluşturulmuştur. Bunların çoklu lateral transfer ile farklı prokaryotlardan kaynaklandığı ya da sekonder endosimbiyosis ile katılmış farklı ökaryotlardan miras kalmış olduğu düşünülmektedir. Tüm bu genomlar için bugüne kadar yapılan yayınlar, herhangi bir ökaryogenesis hipotezine kuvvetli bir kanıt oluşturmak için başarısız olmuştur. Archezoa’ların mirası aynı zamanda zaten ökaryot olan mitekondriyal endosimbiyont için konak olduklarından emin olabileceğimiz anlamına gelir.

miRNA ve KANSER

miRNA (microRNA) NEDİR?

İnsanlarda sayıları bini geçen, protein kodlamayan ve gen ifadesini kontrol eden, yaklaşık 20- 23 nükleotit uzunluğunda tek iplikçikli RNA molekülleridir. İlk defa C.elegans’ın gelişimini çalışan Lee ve arkadaşları tarafından 1993 yılında tanımlanmıştır.

miRNA moleküllerinin biyogenezi

1- Hücre çekirdeği içinde RNA Polimeraz II (Pol II) veya III ile pri-miRNA'lar oluşturulur.
2- Rnaz III endonükleaz "Drosha" enzimi ve çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein "Pasha kompleksi” tarafından işlenerek pre-miRNA'ya dönüştürülür.
3- pre-miRNA'lar çekirdek zar proteini "exportin-5" aracılığıyla sitozole aktarılır.
4- Sitosole aktarılan pre-miRNA’lar doğrudan Rnaz III endonükleaz "Dicer"a bağlanır.
5- Dicer, pre-miRNA sap-ilmiğini kestikten sonra, iki tamamlayıcı kısa RNA molekülü meydana gelir.
6- Dicer aynı zamanda RNA-indüklenmiş susturma kompleksi (RNA-induced silencing complex) RISC’nin oluşumunu başlatır.
7- Bu iki kısa RNA’dan sadece biri RISC’e dahil olur.


miRNA – mRNA İlişkisi

miRNA'lar, bir veya daha çok mesajcı RNA (mRNA)’nın 3’ UTR dizisi ile kısmî tamamlayıcıdır. Bazı miRNA’lar 5’ UTR ve/veya ORF (open reading frame)’den de bağlanabilir.

RISC mRNA’ya bağlandıktan sonra ya Keser ya da translasyonunu engeller

a- Eğer miRNA-mRNA baz tamamlayıcılığı mükemmel ise;
RISC’in içinde yer alan argonaute proteinleri tarafından mRNA'nın yıkımı gerçekleştirilir. Genellikle bitkilerde gözlenir.

b-Kısmi ise;
Translasyon inhibisyonu gerçekleştirilir. Bu da; mRNA’nın poli-A kuyruğunun kesilmesi ve destabilitazyonu ile sağlanır. Genellikle hayvanlarda gözlenir.

miRNA’lar Düzenleyici Olarak Görev Alırlar

• miRNA’lar mRNA’nın yıkımına (genellikle bitkilerde), mRNA’nın ribozomlar tarafından tanınmasını engelleyerek trasnlasyonun inhibe edilmesine (genellikle hayvanlarda) ya da nükleusa giderek DNA’nın metilasyonunu sağlayarak transkripsiyonel sessizleştirmeye (genellikle maya ve bitkilerde, belki hayvanlarda)
neden olur.
• miRNA'larının bazıları onkogen, bazıları ise tümör baskılayıcı gen gibi işlev görür ve tümör progresyonu, metastazı ve invazyonunda düzenleyici olarak görev alırlar.
• miRNA'lar gelişme, farklılaşma, sağkalım, apoptozis, senesens ve metabolizma gibi çeşitli biyolojik olayların kontrolünde görev aldıkları için anlatımlarındaki azalma ya da artma çeşitli hastalıklara ve kansere neden olabilmektedir.




miRNA /          Genomdaki           / Fonksiyonu /    Hedef mRNA’lar 
                      organizasyonu

miR-15-a              13q13        Tümör supressör        BCL2        Anlatımı azaldığında
miR-16-1                                                                               MCL1        onkogen mRNA'ların
                                                                                                                    miktarı artar.                                                                                                                        

miR-29-a                7q32       Tümör supressör       CDK-6        Anlatımı azaldığında
miR-29-b1              1q30                                                                           onkogen mRNA'ların
miR-29-b2                                                                                                  miktarı artar.
miR-29-c                


miR-21                  17q21            Pro-onkogen             PTEN          Anlatımı arttığında
                                                                                                           tümör suppesör mRNA’ların                                                                                                               miktarı azalır.



Kanserli Hücrelerde miRNA Anlatımı a-Azalır ya da b-Artar

a) miR-15-a ve miR-16-1 miktarının azalması sonucu Bcl-2’nin ekspresyonunun artması ve kanserleşme

Normalde bir hücrede Bcl-2 aktiftir ve citokrom-c’nin mitekondri dışına çıkışını engeller. Eğer hücreye ölüm sinyali gelirse Bcl-2’ in translasyonu miR-15-a ve miR-16-1 tümör supressör miRNA’ları tarafından engellenir ve mitekondri dışına citokrom-c çıkışı gerçekleştirilir. Böylece hücre apoptosa götürülür.

miR-15-a ve miR-16-1 miktarındaki azalma Bcl-2’nin inhibisyonunu aksatacağından hücre apoptostan kurtulur ve kanserleşmeye gider.

Örn; Prostat Kanseri
Bonci ve ark. miR-15a ve miR-16-1 geninin prostat kaserli dokuda sağlıklı dokuya göre ifade edilme düzeyinin yaklaşık %80 azaldığını belirlemişlerdir.

Örn; B cell kronik lenfositik lösemi
B cell kronik lenfositik lösemide mir-15a ve mir-16-1 delesyona uğramıştır.



b) mir-17-92’nin ekspresyonunun artması sonucu PTEN’nin ekprsyonunun azalması ve kanserleşme

Normal hücrede büyüme faktörü geldiği sürece PTEN’nin mir-17-92 tarafından aktivitesi engellenir. Buna bağlı olarak bölünmeyle ilgili genler aktif hale geçer ve hücre bölünmeye gider. Eğer bir ölüm sinyali gelirse mir-17-92 anlatımı azalır, PTEN translasyonu gerçekleşir ve inositol-3-fosfokinaz(PI3K)’ın aktivitesi engellenerek hücre apoptosa gider

Tümör hücrelerinde mir-17-92 genlerinin anlatımın çok olması PTEN’in aktivitesini sürekli engelleyeceğinden hücre bölünmesi kontrol edilemeyecek, hücre apoptosdan kaçacak ve kanserleşme görülecektir.

Örn; Prostat Kanseri
Yapılan bir araştırmada mir-17-92 geninin prostat kaserli dokuda sağlıklı dokuya göre ifade edilme düzeyinin yaklaşık %47 arttığını belirlemişlerdir.

Sonuç;

Genomun kodlanan genlerinin majör düzenleyicilerinden biri olarak tanımlanan miRNA’lar, moleküler tıpta hedefe yönelik terapötik biyomarkerların belirlenmesinde umut verici unsurlar olarak karşımıza çıkmaktadır.

Örneğin; prostat kanseri için,
-kanserin sınıflandırılmasında,
-tanımlanmasında ve
-tedavi yönteminin seçiminde
miR-15a, miR-16-1 ve mir-17-92; anlatımlarındaki farklılıklardan dolayı marker olarak kullanılabilir.

İNSAN B-LENFOSİTLERİNİN PLURİPOTENSİ İÇİN HETEROKARYON TABANLI YENİDEN YAPILANDIRILMASI İÇİN OCT4’E İHTİYAÇ DUYULURKEN SOX2’YE GEREK DUYULMAZ

 

Özet

Farklılaşmış hücreler, embriyonik kök hücreyle füzyonu sonucu heterokaryon oluşumu ile yeniden yapılandırılabilir. Bu makalede şu kanıtlanmak istenmiştir: B lenfositlerinin multipotent hale dönüşümü daha önce düşünülenin aksine nükleer füzyon ve hücre bölünmesinden önce oluşan geçici heterokaryon kullanımı ile daha hızlı gerçekleşir. İlginç olanı ise, yeniden yapılandırılmış B lenfosit hücrelerinde insan kök hücrelerine özgü genlerin    ( İSSEA4, İFGF reseptör ve ligandları) anlatımı yapılırken fare kök hücrelerine özgü genlerin (örn; Bmp4 ve LIF reseptörleri) anlatımı yapılmamasıdır. Genetik olarak yapılandırılmış fare kök hücrelerinin kullanımıyla şu kanıtlanmak istenmiştir: indüklenmiş pluripotent hücre için gerekli olduğu düşünülen Sox2'den bağımsız olarak insan lenfosit hücrelerinde başarılı bir yeniden düzenlenme yapılabilir. İleriki aşamalarda gereksinim duyulmamasının aksine başlangıçta Oct4'e belirgin şekilde ihtiyaç duyulur. Farklılaşmanın başlaması ile birlikte Oct4 sentezi de azalır. Bu nedenle deneysel heterokaryonlar, yeniden programlanmış insan hücrelerinin multipotent hale gelmesi için gerekli özgün faktörlerin izlenmesine olanak verir.

Kök hücre özelliği kazandırılmak için yeniden yapılandırılan somatik hücreler çoğaltılabilir ve doku naklinde hastaya özgü kök hücreler gibi kullanılabilir. Bu nedenle bu hücreler, hücre terapilerinde önemli bir çalışma alanıdır. Epigenetik düzenlenme, nüklear transfer ya da bir ve ya birden fazla transkripsiyon faktörünün ekspresyonunun sağlanması gibi birçok farklı yollarla gerçekleştirilebilir. Her ne kadar kök hücrelere göre daha düşük düzeyde de olsa; Oct4,  Sox2,  c-Myc ve Klf4 transkripsiyon faktörlerinin retroviral aracılı ekspresyonları,  fibroblastların kök hücreye dönüşümünü kontrol ettiği görülmüştür. Ayrıca; yeniden yapılandırılmış insan fibroblastlarında Oct4 ve Sox2'nin kullanımı ile Nanog+Lİn28 ya da Klf4+c-Myc2’nin kullanımında paralellik gözlemlenmiştir. Bu ön çalışmalar, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPS) için gerekli birkaç faktörü ortaya koymuş ve verimli pluripotensi dönüşümü için bunlardan birinin olması gerektiğini ortaya çıkarmıştır. Yeniden yapılandırma bunların yanında hücre füzyon yöntemi ile de yapılabilir. Örneğin; pluripotent bir hücreyle, embriyonik karsinoma hücreleriyle ya da embriyonik germ hücreleriyle füzyonu sonucunda, farklılaşmış bir hücrenin somatik kromozomlarında pluripotensiyle ilişkili genlerin aktivasyonu sağlanır. Farklılaşmış hücrede genlerin epigenetik olarak düzenlenmesiyle yapılan hücre yapılandırılması, nuklear füzyon ve genom duplikasyonuna yüzde yüz gerekli olup olmadığını kesin olarak göstermemektedir. Burada B hücrelerinin yeniden programlanması için fare embriyonik kök hücreleri(fEK)’yle füzyonunun zorunlu olup olmadığını araştırılmış ve B Lenfosit ve kök hücre nukleusları tarafından oluşturulmuş heterokaryonda yeniden yapılanma olduğu ve tekrarlandığı gözlenmiştir. Ayrıca B hücrelerinin kök hücre gibi başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması için Oct4 gerek duyulurken Sox2’ye gerek duyulmadığı gösterilmiştir. Burada elde edilen datalar insan hücrelerinin pluripotensi için düzenlenmesinde gerekli faktörlerin belirlenmesinde alternatif bir yol oluşturabilir.

SONUÇ

Nuklear Füzyon Sonrası Heterokaryonda Yeniden Yapılandırma Genlerinin Ekspresyonunun Başlatılması  

Polietilenglikol(PEG) kullanılarak insan B hücreleri(hB) ve fare Embriyonik Kök hücreleri (fEK) füzyona uğratılmış ve füzyon sırasındaki nüklear olaylar flüoresan mikroskopunda ve RT-PCR’da gen ekspresyon analizleri ile gözlemlenmiştir. Füzyon hücrelerinin ayırt edilebilmesi için E14tg2 fare embriyonik kök hücreleri DiD ve insan B hücreleri DiI ile işaretlenmiştir. İkisi ile işaretlenen heterokaryon hücreler (heterokaryonlar) ise FACS ile ayrılmışlardır. Hücre füzyonunu takip eden 2. gün füzyon hücrelerinin  % 98-99’u iki marker ile işaretlenmiş bir insan ve bir fare nükleusu içeren ve heterokaryon olarak adlandırılan hücreleri vermiştir. Nüklear füzyon ayrıca insan kromozomuna özgü (α-satellite, yeşil) ve fare kromozomuna özgü ( γ- satellit, kırmızı) probların kullanılmasıyla flüoresan insitu hibridizasyon  (FISH)  yöntemi ile de gözlemlenmiştir.

B lenfosit kaynaklı nükleusta pluripotensi ve lenfosit ilişkili genlerin ekspresyonları qRT-PCR’da gözlenmiş ve füzyondan hemen hemen 1 gün sonra insan Oct4, Nanog, Cripto, Dnmt3b ve Tle1 genlerinin ve 2 gün sonra insan Rex1 genlerinin ekspresyonları gerçekleşmiştir. Heterokaryonda seviyeleri düşük olmasına rağmen (incelenen insan hücrelerinin %1’inde), zamanla miktarları artmıştır. Fakat füzyon yapmamış ya da kendi kendine füzyona uğramış insan ve fare hücrelerinde gözlenmemişlerdir. Tüm aşamalarda iHprt ekspresyonu eşdeğer olarak gerçekleşirken tahmin edildiği gibi iTert ekspresyonu 4. günden itibaren gözlenmiştir. 8 günlük periyot sürecinde heterokaryonda fare lenfositlerine özgü gen transkriptleri gözlenmemiş fakat ikinci gün insan B lenfositlerine özgü genler olan iCD45, iCD37 veihCD19 genleri ile üçüncü gün iCD20 ve iPax5 genlerinin anlatımlarında azalma, insan pluripotensi ilişkili genlerin anlatımında artış gözlenmiştir. Tüm bu veriler, yeniden yapılandırmada doku spesifik genlerin aktivasyonunun ya da inaktivasyonunun heterokaryonda nükleus füzyonu ve hücre bölünmesi olmadan ve bunlara gerek duyulmadan başladığını göstermektedir. Ek olarak, gen ekspresyonun sonuçları populasyon düzeyinde test edildiğinden buyana, heterokaryon ve hibrit hücreler arasında gen ekspresyonu bakımından farklılık olması mümkündür. Oct4 ve kontrol olarak Igf2/H19 impirintlenme noklalarının (ICR) metilasyonlarındaki değişiklikleri incelenmiş ve füzyon hücresi insan B lenfosit hücrelerinde iOct4 promotörleri boyunca ve Igf2/H19 allelerinde çapraz olarak metilasyon olduğu görülmüştür. İnsan kök hücre hattı H1’de karakteristik özelliği olan hipometilasyona benzer, hücre füzyonu ile insan lenfosit hücrelerinde de metilasyonda azalma gözlenmiştir. Lokusların ekspresyon öncesi düzenlenmesiyle tutarlı olarak, nüklear füzyon ve hücre bölünmesi öncesi heterokaryonda iOct4 promotörlerinin demetilasyonu gerçekleşirken, Igf2/H19 ICR’lerinde DNA metilasyonunda bir değişiklik olmadığı ve imprintli durumlarını sürdürdüğü gösterilmiştir.

İnsan Kök Hücre’ye Özgü Genlerin Ekspresyonlarının İndüklenmesi

Yeniden yapılandırılmış insan B hücrelerinde gen ekspresyonu bir kaç insan kök hücre hatları (NCL1 , HI, H7, H9) ile benzerlik göstermektedir. Tüm insan ve fare kök hücreleri hattında Oct4 ekspresyonu bolca yapılır. Nanog ve Cripto ekspresyonları, Oct4’e göre incelenen her bir fare embriyonik kök hücresinde (OS25,CCE, E14, ZHBTc4) tutarlı olarak daha az (100-1000 kat kadar) olmaktadır. Fakat insan hücreleri hattında ve insan B lenfosit hücrelerinde Oct4’le birlikte Nanog ve Cripto’nun ekspresyonu da bol miktarda yapılmaktadır. Sox2 gibi bazı pluripotensi ilişkili genlerin ekspresyonları değişkendir ve genellikle tespitleri için uzun bir zaman geçmesi gerekir (8 günden daha fazla). Bu da Sox2’ nin B hücrelerinde DNA ve histon metilastonunu kapsayan modifikasyonlar ile geç replikasyon için gerekli bir öğe olduğunu gösterebilir. İnsan embriyonik kök hücre (iEK) hatları ile insan B lenfosit-fare embriyonik kök hücre füzyonu (iB x fES)’ndaki gen ekspresyonu benzerlikleri, sadece insan hücresi tarafından yapılan fibroblast büyüme faktörü reseptörü (Fgfr1 ve Fgfr2 ve bir glikoprotein olan hücre yüzey reseptörü SSEA4 ya da sadece fare hücreleri tarafından ekspresyonları olan genleri (Bmp4) ve lösemi inhibitör faktörlerini (Lif) araştırmaya yönlendirdi. Yapılan araştırmalar yeniden yapılandırılmış hücrede iFgfr1, iFgfr2 ve iFgf2 genlerinin anlatımı olurken iBmp4 ya da iLifr ekspresyonu olmadığını göstermiştir. Bu bilgi şunu ifade eder:  fare embriyonik kök hücrelerinin kullanılmasıyla gerçekleştirilen yeniden yapılandırılmış heterokaryon ve hibrit hücreler insan hücrelerine fare hücrelerinden daha benzer bir profil gösterir. Bununla uyumlu olarak füzyon hücrelerinin %13-16’sında SSEA4 ekspresyonu gözlenmiştir. SSEA4 bakımından pozitif işaretli hücreler başarı ile füzyona uğramış yeniden düzenlenmiş hücrelerdir ve iOct4, iNanog ve  iCripto genlerinin ekspresyonlarını yaparken SSEA4 bakımından negatif işaretli hücrelerde bu genlerin ekspresyonları olmaz ve yeniden düzenlenmeleri gerçekleşmez. Yeniden yapılandırılması başarıyla gerçekleştirilmiş heterokaryon, belki iOct4 metilasyonuna ve SSEA4 ekspresyonuna bakılarak, yeniden yapılandırılmış insan hücrelerinde pluripotensi faktörlerini kodlayan transkriptlerin iEK hücre hatlarına göre neden daha az olduğunu açıklayabilir. fEK hücreleriyle yeniden yapılandırılan insan B lenfosit hücrelerinin çoklu hücre soylarını verip vermeyeceğini araştırmak için, iB x fEK kültürü hücre füzyonundan 6-8 gün sonra farklılaşmayı uyarmak amacıyla Retinoik Asit (RA) ile muamele edilmiştir. RA ile muameleden önce birçok iB x fEK kolonileri alkalin fosfataz (AP) aktivitesi göstermiş ve insan AP transkriptlerinin ekspresyonlarını gerçekleştirmiştir. Hibrit kolonileri aynı zamanda pluripotensi marker genlerinin (iNanog proteini) ve insan embriyonik spesifik antigenlerinin (SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81) de ekspresyonunu yapmıştır. RA ile muamelenin ardından, koloniler arasında morfojenik heterojenite artarken, AP aktivitesi ve iOct4, iNanog ve iRex1 genlerinin ekspresyonunda azalma olmuştur. iB x fEK  hücrelerinde AP ile indüklenmiş ekstra embriyonik (iCdx2,  iHand1 ve iGata6), endoderm (iSox7, iHnf4 ve iCollagenIVaI) ve ektoderm (iMixl1, iEbf ve iMyoD) farklılaşması gözlenirken, kontrol insan B hücrelerinde gözlenmemiştir. Ayrıca farklılaşma, farklılaşmış insan hücrelerine benzer şekilde iOct4 promotörünün metilasyonu ile sonuçlanır. Tüm bu çalışmalar göstermiştir ki; fare embriyonik hücresiyle yeniden düzenlenmiş insan B hücresinde genlerin ekspresyonları düzenlenir ve çoklu hücre soylarına farklılaşma gözlenir.

            İnsan B Hücrelerinin Türler Arası Yeniden Yapılandırılmaları fOct4’ye İhtiyaç Duyarken fSox2’e Gerek Duymaz.

Oct4, embriyonik kök hücrede düzenlenme sisteminin temel bir parçasıdır ve kendini yenilemesi ve pluripotensi için esansiyeldir. Türler arası heterokaryonda fOct4’ün ( fare kaynaklı Oct4) potensiyelini gözlemlemek için Flag İşaretli fare embriyonik kök hücreleri oluşturulmuş ve insan B lenfositleriyle füzyona uğratılmıştır. Hücre füzyonundan 3- 6 saat sonra fare EK kaynaklı Flag işaretli Oct4’lerin insan nükleuslarında toplandığı görülmüştür.  Ayrıca iOct4 transkripsiyonu başlamadan önce (24 saat) Oct4 proteinleri heterokaryon nükleusunda bulunduğu gözlenmiştir (3saat sonra). Böylece insan lenfosit hücrelerinde yeniden yapılanma daha olmamışken EK kaynaklı Oct4 translasyonu gerçekleşir. İnsan fibroblast hücrelerinin EK benzeri hücrelerine dönüşümleri en az dört faktöre (Oct4, Sox2, Nanog ile birlikte Lin28 ya da Klf4 ile birlikte c-Myc) ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Sox2 içermeyen fare EK son zamanlarda göstermiştir ki; Oct4’ün yüksek miktarlarının sağladığı pluripotensi, ekstra embriyonik farklılaşmanın durdurulması için büyük önem taşıyan Sox2 tarafından engellenebilir. Yeniden yapılandırmada Sox2 ile Oct4 arasındaki önem ilişkisini incelmek için insan B hücrelerine füzyon partneri olarak Sox2 ya da Oct4 için indüklenmeleri engellenmiş (tet-off) fare embriyonik kök hücreleri kullanılmıştır. Bu fEK hücre hatlarının Doxycycline (+Dox) ile muamelesi sonucuda hemen ve hızlı bir şekilde Oct4 ya da Sox2 gen/protinlerin ekspresyonları ortadan kaldırılır. ZHBTc4 ( endojen Oct4 geni Dox ile downregüle edilebilen Oct4βgeo transgeni ile değiştirilmiş fare EK hücreleri)’n Dox ile 6-12 saat için ön muamelesi diğer pluripotensi ilişkili genlerin ekspresyonlarına ya da B hücreleriyle füzyon yapma yeteneğine önemli bir etki yapmadan fOct4'ün kademeli olarak azalması ile sonuçlanır. Başarlı bir yeniden yapılanma için gerekli bir kaç insan geni ZHBTc4 hücrelerinin Dox ile ön muamelesi sonucunda (6 saat sonrasında) azalırlar ya da yok edilirler (12 saat sonra). Aynı şekilde fOct4’lerin siRNA (short interference RNA)’lar ile yok edilmesi de E14tg2a fare EK hücrelerinin yeniden programlanmasını engeller. Bu bilgiler başarılı bir yeniden yapılanma için Oct4’ün kritik bir önemde olduğunu doğrular. İnsan lenfositlerine özgü genlerinin yok edilmesi hiçbir şekilde Oct4’ün ortadan kaldırılmasıyla etkisiz hale getirilemez. Bu sonuç belki, heterokaryonda ileride gerçekleşen gen ekspresyonlarının aktive edildiğine ve susturulduğuna kanıt olabilir.

Endojen Sox2 geni Dox ile downregüle edilebilen Sox2Zeo transgeni ile değiştirilmiş 2TS22C fEK hücrelerinde Sox2 ekspresyonunun engellenmesi ise Oct4’ün aksine yeniden yapılanmayı çok az etkiler. Ayrıca 2TS22C fare EK hücreleri 2O1 (Sox2 bakımından eksik) hücreleriyle füzyona uğratıldığında yeniden yapılanma kusursuz bir şekilde gerçekleşmektedir. Bu veriler yeniden yapılanma için Oct4’ün gerekli olduğunu Sox2’nin gerekli olmadığını göstermektedir. Ayrıca 2O1 ile füzyona uğratılmış 2TS22C hücrelerinde iSox2’nin indüklendiği gözlenmiştir. Bu da fOct4 miktarındaki artışın somatik nükleusta Sox2’in ekspresyonunu indüklediği fikrini akla getirir.

Embriyonik Kök Hücre Kökenli Oct4 Hücrenin Yeniden Yapılanmış Durumunu Devam Ettirmesi İçin Gerekli Değildir

Yeniden yapılanmış hücreler gen ekspresyonlarını bağımsız olarak sürdürebilirler mi yoksa fare EK hücrelerinin sağladıkları devam ettirici faktörlere mi gerek duyduğunu araştırmak için lenfosit ve bilinçli olarak Oct4 anlatımının baskılandığı EK hücre (ZHBTc4)  ile hibritlenmiştir. Bu şekilde,  başarılı bir yeniden yapılanma gerçekleştirmiş füzyon hücrelerinin 10 gün sonunda GFP sentezinin yeniden başlamasının temeli araştırılmıştır. Beklendiği gibi hibrit hücreler ZHBTc4 kaynaklı Oct4βgeo ve bazı pluripotensi ilişkili genlerin ekspresyonlarını gerçekleştirirken B hücresine özgü CD19, Pax5 ve Ly108 gibi genlerin ekspresyonlarını gerçekleştirmemiştir. Hibrit hücreler Dox ile muamele edilmiş ve ZHBTc4 kaynaklı Oct4βgeo transkriptlerinin downregülasyonu gerçekleştirilmiştir. ZHBTc4 kaynaklı Oct4’ün geri çekilmesi, yeniden yapılandırılmış hücrede iNanog ve iSox2 genlerinin ekspresyonlarını değiştirmemiş, trofektoderme farklılaşmasını hızlandırmamış ya da embriyonik marker olan fCdx2 ve fHand1’in ekspresyonlarını arttırmamıştır. Kısacası parental ZHBTc4 hücre hatları tarafından indüklenen olayları değiştirmemiştir. Yapılan bu çalışma gösterir ki; lenfositlerin fare EK hücreleri ile yeniden programlanması, lenfosit nükleusunda epigenetik (ve kalıtsal ) olarak genlerin düzenlenmelerini indükler.   

TARTIŞMA

Bu çalışmada fare embriyonik kök hücrelerinin insan lenfositleri için füzyon partneri olarak kullanılmasıyla, yeniden yapılandırılabileceği, normalde insan blastosist ve insan EK hücre hattı gelişimi ile ilgili endojen genlerin yeniden düzenlenip ekspresyonlarının sağlanabileceği gösterilmiştir. Türler arası gerçekleştirilen başarılı yeniden yapılanma, heterokaryonda kromozomların rekombinasyonlarını ve insan FGF sinyal yolu bileşenleri ile SSEA4, TRA-1-60 ve TRA1-81 gibi insan EK hücreye özgü yüzey moleküllerin ekspresyonlarını başlamasını kontrol eder. Fare EK hücrelerinin yeniden programlanma kapasitelerinin Oct4 delesyonu ile durdurulmasına kadar yeniden programlanmanın Oct4'e bağımlı olarak gerçekleştiği gösterilmiştir. İnsan B lenfositlerinin EK hücre benzeri dönüşümleri sonucu iOct4 lokusunda DNA metilasyonunun kaybı ile somatik genomda yeniden modellenmeyle sonuçlanır. Önemli olanı ise, yeniden programlanma bir kez dominant nukleus  (EK hücre nukleusu) tarafından sentezlenen faktörler tarafından başlatıldıktan sonra Oct4’den bağımsız olarak gerçekleştiği, Oct4’ün engellenmesinin hibrit hücrede fenotipe yansımaması ile gösterilmiş olması.

Bu çalışmaların hepsi yeniden programlanmanın bir kere başlatıldıktan sonra kendiliğinden devam ettiğini ve kalıtsal olduğunu gösterir. Burada gösterilen yeniden yapılandırma verilerinin bir şaşırtıcı yönü de, heterokaryon içinde hızlı bir gen dönüşümü ve DNA demetilasyonunun gerçekleşmesidir. Başarılı bir yeniden yapılandırma heterokaryonlarda belirli bir kısmında (>%13) meydana geldiği gibi, muhtemelen lenfositlerin dönüşümü için DNA’nın kısmi replikasyonuna (DNA tamiri) ihtiyaç duyulur. Daha önce yapılan çalışmalar, farklı hücre hatlarından elde edilmiş yetişkin hücrelerin kullanıldığı deneysel heterokaryonlarda genom duplikasyonu ve hücre bölünmesi olmadan yeniden programlanabileceği gösterilmiş, burada da unipotent lenfositlerin multipotent hücreye dönüşümünün geçici heterokaryonda yine hücre bölünmesi olmadan gerçekleşebileceği gösterilmiştir. İnsan Oct4 ve Nanog genlerinin insan nukleusunda yeniden aktivitesi DNA demetilasyonu ile sağlanmıştır. İnsan Oct4 ve Nanog’ların Xenopus oositleri ile yeniden aktivitesi, DNA’nın hızlı bir şekilde demetilasyonu ve Tpt1 aktivasyonu ile sonuçlanmıştır. Türler arası heterokaryonda endojen pluripotensi ilişkili genlerin hızlı bir şekilde yeniden aktivasyonu,  MEFs yada NSCs ile füzyona uğratılmış fare EK hücreleri tarafından ekspresyonu olan Oct4gfp ile yapılan çalışmalarla tutarlıdır. İnsan somatik hücrelerinde fare EK hücrelerinim dominant bir şekilde çoklu hücre hatlarını verebilme potansiyelini yok ettiği ipatlanmıştır. Bu nedenle, heterokaryondan fare kromozomlarının çıkartılma çalışmaları, insan kök hücrenin kontrolü için uygulanabilir ve multipotent yapılandırmada kritik olduğu düşünülen proteinlerin rollerinin ayrıntılı olarak incelenmesi için alternatif olarak fare EK hürelerinin kullanılması, soy hatlarının verebilecek potensiyeli yeniden oluşturmak için farklı protein karışımlarının kullanılmasına mantıklı bir açıklama getirebilir.

Burada yapılan deneylerle gösterilmiştir ki; yeniden yapılandırılmış insan hücreleri fare EK hücrelerinden farklı ve insan EK hücrelerine özgü olan transkriptlerini, sinyal moleküllerini ve hücre yüzey antijenlerini sentezler. Bu da, insan nükleusunda erken embriyonik genlerinin ekspresyonlarının trans-etkili (fareye ait) faktörlerle başlatılabileceğini akla getirir. Fare EK hücre nükleusu ile insan yeniden yapılandırılmış hücre nükleusu arasındaki ekspresyon farkı, muhtemelen insan ve fare genomları arasındaki cis- etkili bölgelerin bölgesel farklılıklarını yansıtır. Fareye sokulmuş iTert geni ile yapılan tüm çalışmalarda insandaki endojen iTert ekspresyonuyla benzer olarak fTert'den daha çok iTert'in ekspresyonu gözlenmesi de bu fikre destek olmuştur. İnsan lenfositlerinin fare EK hücreleri ile füzyonu sonrasında, insan EK hücre benzeri hücrelerin FGF sinyal bileşenleri tarafından kontrol edildiği ve Lif/Bmp’den bağımsız olduğu gösterilmiştir. Bu veriler; insan ile fare EK hücreleri arasındaki iyi tanımlanmış farklılıkların, kök hücrelerin embriyogenez sırasında ne zaman ve nereden izole edildiğinden çok, farklı sinyalizasyon ve transkripsiyonel ağları yansıttığını gösterir.

Burada yapılan çalışmalarla Oct4’ün aksine Sox2’nin lenfositlerin multipotent hale dönüşümü için gerekli olmadığı gösterilmiştir. Bu gözlem fare ve insan fibroblastları, fare hepatositleri, mide hücreleri ve fare B lenfositleriyle daha önce yapılan yeniden yapılandırma çalışmalarıyla tezat oluşturur. Bunun nedeninin iPS de kullanılan transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarındaki farklılıklarından mı yoksa yeniden yapılanma uzun bir zaman sürecinde meydana geldiğinden (örneğin; Oct4, Nanog ve Sox2 gibi pluripotensi ilişkili genler transdüksiyondan 2 hafta sonra aktive olurlar) dolayı mı olduğu bilinmiyor. Fakat son zamanlarda fare EK hücrelerinde Oct-Sox enhancerlerinin aktivasyonu için Sox2'nin vazgeçilebilir olduğu gösterilmiştir. Hatta Sox4,Sox11 ve Sox15 gibi Sox aile üyelerinin eklenmesi de yeniden programlanma için gereksiz olabilir. İlginç şekilde, Sox2 eksik EK hücrelerde ( EK 2O1) Oct4 enhancerlarının miktarı ile yeniden yapılanmış insan B hücresinde iSox'nin ekspresyopnundaki artış gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan genom çalışmalarında hem insanda hem farede Sox2'nin Oct4 için direkt hedef olduğu gösterilmiştir. Bu da iSox2'nin neden yüksek Oct4 aktivitesi olan fare EK hücresinin kullanılması ile etkin bir yeniden yapılanmaya sebep olduğunu açıklayabilir. Kontrol altında gerçekleştirilen lenfositlerde ekzojen Oct4'ün overekspresyonu pluripotent dönüşümü başlatmaz. Bunu başlatan, kromatin yeniden düzenlenme faktörlerinin eklenmesi, kritik olan Oct4’ü etkinleştirilmesi ya da DNA'nın demetilasyonunun sağlanması olduğu düşünülmektedir. Kısacası, türler arası heterokaryon iPS için ilginç ve ücretsiz bir yaklaşım oluşturmakta ve pluripotensinin indüklenmesi için gerekli faktörlerin ayrı ayrı ve birlikte incelenmesine izin vermektedir.

POPÜLASYON GENETİĞİ

POPÜLASYON GENETİĞİ

 popülasyonlardaki fertlerin benzerlik ve farklılıklarının kaynaklarını araştıran bir genetik alt dalıdır.

Dört ana madde üzerinden yola çıkarak araştırmalar yapar;

·        doğal seçilim,

·        gen havuzu,

·        mutasyonlar

·        gen devamlılığı

Gen Havuzu Nedir?

Genetikçi, populasyondaki fertlerin bütün genlerinin bir havuzda toplandığını düşünür. Bu havuz erkek fertlerin ve dişi fertlerin genlerinin toplandığı iki ayrı havuzdan meydana gelmiştir. Kısaca, bir populasyonun bütün genlerine gen havuzu diyebiliriz.

Gen Frekansı Nedir? :

Genel olarak, bir  populasyonda  her bir lokusda bulunan tek tip bir alelin  frekansı %100 yada 1.0 e eşittir. Ancak, eğer iki tip alel varsa ki diploid bir organizmada durum budur; birinin frekansı “p”, diğerinin frekansı “q” ile gösterilir. Matematiksel olarak rastgele eşleşme yapan kapalı bir populasyonda  p+q = 1’e eşittir. Canlının üremesi sırasında yumurta hücresindeki p+q alelleri , sperm hücresindeki p+q alelleri ile birleşir. Bu birleşme sonucu;

           (p + q) x (p + q) = (p + q)2 = p2 + 2pq + q2

    Ortaya çıkan değerler bize populasyondaki tüm genotiplerin oranlarını vermektedir. Biston betularia’da populasyon ;

                     p2 = MM,  2pq = 2Mm,  q2 = mm

                              Genotip frekansları

Bu populasyonun % 81’nin tipik bireylerden, % 19’unun melanik bireylerden oluştuğunu hesaplasaydık,

Not= Melanizm dominant bir gen (M) tarafından kodlanır. Doğal rengi kodlayan gen ise resesif (m) durumdadır. Her kelebek 2 alel taşır ; M ve m. MM ve Mm genotipleri melanik, mm genotipi doğal renkteki bireyleri oluşturur. 

Gen frekansları:
q= m’nin frekansı      q2= 0,81 ise q= 0,9
p= M2nin frekansı    p= 1- 0,9= 0,1
p2 = 0.01 (MM) 2pq = 0.18 (Mm)
Bu populasyon içindeki eşleşmeler sonucu bir sonraki döl oluşur.
Üreme sırasında neler olur?

ü      Mayozda aleller gametlere ayrılır.

ü      Gametler bu alelleri populasyondaki frekansları oranında taşırlar

Yani; spermde M’den p oranında ve m’den de q oranında bulunur.
Yumurtalarda M’den p oranında ve m’den de q oranında bulunur

•         Yumurta ve spermler zigotları oluşturmak üzere birleşirse =

SPERM	YUMURTA
	M (p = 0.1)	m (q = 0.9)
M (p = 0.1)	MM (p2 = 0.01)	Mm (pq = 0.09)
m (q = 0.9)	Mm (pq = 0.09)	mm (q2 = 0.81)

Üremeden sonra (Biston betularia) ;
Homozigot dominantlar = MM = p2 = 0.01
Heterozigotlar = Mm = 2pq = 0.18
Homozigot resesifler = mm = q2 = 0.81
Melanikler = 0.19 (0.01 + 0.18)
Tipik renktekiler = 0.81
   Sonuçta dölde p ve q ile gösterilen alel frekanslarının ve genotip frekanslarının değişmediğini görürüz.

Hardy-Weinberg prensibi (HWP):

1.      Üreme sadece populasyon içerisinde meydana gelmelidir, yani populasyonun ebeveynlerinin hepsinin aynı populasyonun bir önceki üyeleri olması gerekir. Bir başka deyişle t generasyonundaki bir bireyin sadece t generasyonundaki diğer bir bireyle karşılaştığı kabul edilir. Generasyonların üstüste gelmesi kabul edilemez.

2.      Populasyon içerisinde eşleşmelerin tesadüfi olması gerekir. Bu populasyon içindeki bir bireyin diğer bir bireyle karşılaşma şansının eşit olmasıdır. Aynı şekilde her eşleşmeden meydana gelen gametlerin birbirleriyle eşleşme şansları eşittir.

3.      Kullanılan karakterler Mendellenebilen ve otozomal karakterler olmalıdır. Organizma diploid olmalıdır.

4.      Populasyon yeterli büyüklükte olmalıdır.

5.      Populasyondaki bireylerin üreme güçleri eşit olmalıdır.

6.      Populasyonu etkileyecek seleksiyon, göç, mutasyon ve genetik drift gibi faktörler olmamalıdır.

Gen Oranının Değişmesi Nasıl Olur?

Bir populasyondaki genlerin frekansını etkileyen kuvvetler yoksa populasyon dengededir, gen frekansları ve birey oranları sabittir. Populasyonlardaki denge uzun süre kalamaz. Gen frekanslarını etkileyen faktörler:

–        Mutasyon

–        Gen akışı, göç

–        Rastgele olmayan eşleşmeler

–        Seleksiyon

–        Genetik drift, populasyon darboğazı, çökme etkisi

–        Ve diğerleri

 a) Mutasyonlar:  Bir populasyonda her kuşakta az miktarda da olsa mutasyonlar meydana gelebilir. Bir genin aleli mutasyona uğradığı zaman, bu mutasyon yararlı ise populasyonda devam eder. Dolayısıyla gen havuzundaki frekansı da değiştirmiş olur. Ancak bir müddet sonra gen havuzu tekrar dengeli hale gelir. Eğer gende zararlı bir mutasyon meydana gelmişse, fert öleceği için bu gen kaybolacaktır. Bu durumda da gen frekansı değişir.

 b) Seleksiyon: Gen frekansının değişmesinde diğer bir etken de seleksiyondur. Seleksiyon çevreye uygun varyasyonlara sahip bireylerin seçilip, diğerlerinin elenmesidir.

Mutasyonlar toplumun gen havuzuna yeni genleri dolaysiyla yeni fenotipleri sokma egilimindedir. Mutasyonla ortaya çikan nitelikler söz konusu kisi için zararli, yararli ya da ne zararli ne de yararli olabilir. Etkileri ne olursa olsun gen havuzuna yeni giren mutasyonlar bir süzgeçten geçirilir. Bunlarin bir kismi bir sonraki kusaga geçmeden elimine edilirler. Bir kismi ise bir sonraki kusakta etkilerini gösterebilir. Bu nedenle Bazı genlerin frekansı artar bazısının azalır. Örneğin hemofili hastalarının, toplumda yaşama ve çocuk sahibi olma ihtimalleri azdır. O halde hemofili geni populasyonda seleksiyona uğramaktadır. Ancak hemofili alellerinin frekansı hiç bir zaman sıfır olmaz. Çünkü, mutasyonun etkisiyle normal aleller hemofili aleline dönüşebilmektedir.

            c) Migrasyon (Göçler = Gen akımı) : Bir popülasyondaki belirli karakteri taşıyan fertler bazı durumlarda diğer bir popülasyona göç edebilirler. Böylece bir popülasyonun gen havuzundaki bir genin frekansı azalırken diğer bir popülasyonun gen havuzundaki genlerin frekansında artış meydana gelebilir.

             d) İzolasyon: Tabiattaki popülasyonlar arasında genetik, fizyolojik, ekolojik ve davranışla ilgili çeşitli izolasyon mekanizmaları vardır. Ancak bunların arasında en önemlisi coğrafik izolasyondur. Popülasyonlar coğrafik olarak ayrıldıkları zaman bulundukları çevrede yaşamlarını sürdürebilmeleri için, mutasyon ve seleksiyonla farklı gen havuzları oluştururlar. Uzun bir süre sonra bu popülasyonlar artık birbirleriyle çiftleşemeyecek derecede farklılaşmışlardır. Bu durum yeni alt türlerin ortaya çıkmasını sağlar.

e) Eşleşmeler:

Rastgele eşleşme (panmiksus): bireylerin fiziksel, genetik yada sosyal bir tercih olmaksızın eşleşmesidir. Diğer bir deyimle, 2 organizmanın eşleşmesi çevresel, kalıtımsal yada sosyal etkileşimlerden bağımsızdır. Bu nedenle, potansiyel eşlerin seçilme şansı eşittir. Hardy-Weinberg prensibinde esastır ancak doğal seleksiyon sürecinden bağımsızdır .

Rastgele olmayan evlilikler: Toplumda zararli ya da yararli resesif bir gen için hem homozigot hem de heterezigot kisiler bulunur. Eger toplumdaki kisiler rastgele degil de örnegin homozigotlar homozigotlarla, heterezigotlar heterezigotlarla evlenecek olursa dogacak homozigotlarin sayisi artmis olacaktir. Akraba evlilikleri de rastgele olmayan evliliklere girer. populasyonda genetik etkisi heterozigotların azalması’dır

f) Genetik drift (kayma) bir genin populasyondaki dagiliminin ureme surecinin yol actigi istatistiksel hatanin birikimi sonucunda durgunluga* erismesi. mevcut nesildeki gen dagilimi bir sonraki nesile aktarilirken pratik olarak ornekleme* nedeniyle aktarimda istatistiki bir hata meydana gelir. ornegin a aleli %90, b aleli %10 oranindayken, diger butun faktorlerin disinda sadece ornekleme etkisi* nedeniyle dagilim %80'e %20'ye donusebilir. bir sonraki nesilde yeniden %85'e %15'e cevrilebilir.. matematik bize der ki, bu degisimler, nesilden nesile bir trend olmasa da eninde sonunda duraganlasacak, yani %100-%0 ya da %0-%100 dengesine ulasacak ve o noktada artik tek alel kalacaktir. iste buna verilen addir genetik kayma.

Eğer populasyon küçük ise mutasyon taşıyıcılarındaki fertilite veya yaşam süresindeki artış ya da her ikisi gibi rastgele faktörler mutant allellerin taşınması ile ilgili olmaksızın allel frekansını yükseltebilirler. Büyük populasyonlarda böyle rastgele etkiler ortalamaya karışır ama küçük populasyonlarda şansa bağlı olarak allel frekansları kuşaktan kuşağa dalgalanır. Benzer şekilde büyük populasyondan küçük bir alt populasyon ayrıldığı zaman küçük populasyondaki gen frekansı köken aldığı populasyondan farklı olabilir. Çünkü teni küçük grup rastgele aynı gen frekansında olmayan ebeveyn gruplarını şans eseri almış olabilir. Birkaç jenerasyon küçük grubun büyüklüğü aynı kalırsa da gen frekanslarında önemli dalgalanmalar olur. Populasyon büyüdükçe bu değişiklikler de görülmez olur. Genetik kaymanın bir diğer formu da kurucu etkisidir: eğer yeni bir grubun orjinal ataları nispeten nadir olan bir alleli taşıyorsa bu allel yeni grubun köken aldığı büyük gruba göre çok yüksek frekansa sahip olacaktır.

Bir populasyondan bir kısım birey başka bir bölgeye gider ve orada yeni bir populasyon oluşturabilir. Başlangıç küçük populasyondur ve orada ŞANS başroldedir. Başlangıç aynı, sonu da öyle gelişir. Buna kurucu etkisi “founder effect” denir.

Bu olay heterozigotluğun kaybolmasına ya da azalmasına neden olur.

Founder etkisi: Küçük bir grubun büyük bir  populasyondan ayrılması bu grubun daha sınırlı bir çeşitliliği taşıması anlamına gelir. Örn. Örneğin; sayıları 10 a kadar olan bir grup insani bir odaya  koyduğumuzda, bu grubu A BO kan grubu %90 sıklıkla A kan grubu olsun. Dolayısıyla bu  popülasyonda 2. kuşakta A kan grubu oranı daha fazla olacaktır. Bu yeni izole populasyonda gen frekansları artık koptukları populasyondan farklılık göstermekte, onu temsil etmemektedir.  Bu özellikle “türleşmede” önem taşır.

Founder etkisi iki şekilde gerçekleşebilir;

·        Ya popülasyonda bazı bireyler rastgele olarak uzaklaşır

 

·        Ya da popülasyonun yok olma tehlikesi karşısında birkaç birey hayatta kalır. Bu açıdan popülasyon dar boğazına benzer.

g) Populasyon darboğazı :

 Populasyon boyutu herhangi bir afet sonucu azalabilir ve buda genetik çeşitliliğin azalması ile sonuçlanır (bir nevi yönlendirilmeli bir genetik  genetik drifttir. ) Örneğin, hw kuralına uyan bir böcek popülasyonunda bir kuş türünün bu popülasyondaki sedece siyah böcekleri yemesi, bir sonraki dölde beyaz olanların artmasına sebep olacaktır. Sürekli siyahların yenmesi sonucunda artık siyahlar yok olacak ve bir tek beyazlar kalacaktır

                           Populasyon darboğazı allel frekanslarında değişime yol açar

.Founder- popülasyon darboğaz farkı: popülasyon dar boğazında örn, bir doğal afet olur ve geri kalan bireyler yok olurlar. Founder de ise geriye kalan bireyler hala yaşamayabilir.

ALT POPÜLASYON VE TÜR OLUŞUMU

1) Altpopulasyon nasıl ve neden oluşur?

     Populasyon, fiziksel (topografi, su yada kara, elverişsiz habitat vb.) engeller sonucu bölünürse yeni altpopulasyonlar oluşur. Doğasal veya fiziksel engellerle ayrılan aynı türün bireyleri farklı gruplar (sürü, koloni vb. gibi) halinde izole olarak yaşamaya başlarlar.

      Büyük bir populasyonun bu şekilde ayrılmasıyla oluşan yapılanmaya “altpopulasyon” denir.

Populasyonların alt gruplara ayrılması bir süre sonra rastgele eşleşme göstermeyen (homojen) grupların oluşmasına yol açar.

Örn;

Burada bir genetik drift söz konusudur. Engel kedilerdir ve rastgele şekilde batıda AA fareler doğuda aa fareler daha çok konumlanmış ve ileriki döllerde artık Batı populasyonu A aleli için sabitlenmiştir (Alel frekansı 1’e eşittir) ve doğu pop. ise, a aleli için sabittir (a=q=1).

AA, Aa, aa’nın genotip frekansları  batıda; 1, 0, 0, doğuda; 0, 0 ve 1 olur. Her bir populasyon için rastgele eşleşme devam ettiği sürece, HW kuralı halen geçerlidir. Ancak, çiftliğe kuşbakışı bakıldığında tüm populasyonun durumu farklıdır. Tüm populasyonda heterozigotlar tümüyle eksilmiştir. 

Mohave çölünde resesif alelin q frekansının coğrafik yayılımı, Şekil’de gösterilmiştir.

	Altpopulasyonlar		Bölgeler		Toplam
Bölge	Alel frekansı	Heterozigotluk        2pq	Ort. Alel frekansı ∑Allel fre.   ∑Allel sayısı	Heterozigotluk	Ort Alel frekansı	Heterozigotluk
Batı	0.573 0.717 0.504 0.657 0.302 0.339	0.4893 0.4058 0.5000 0.4507 0.4216 0.4482	0.5153	0.4995
Merkez	9x0.000 0.032 0.007 0.008 0.005 0.009 0.005 0.010 0.068 0.002 0.004 0.126	0.0000 0.0620 0.0139 0.0159 0.0100 0.0178 0.0100 0.0198 0.1268 0.0040 0.0080 0.2202	0.0138	0.0272
Doğu	0.106 0.224 0.411 0.014	0.1895 0.3476 0.4842 0.0276	0.1888	0.3062	0.1374	0.2371
Ortalama Heterozigotluk		HS= 0.1424		HR=0.1589		HT=0.2371

l       HS; rastgele eşleşen altpopulasyonlarda organizmalar arasındaki ortalama heterozigotluk.

l       HR; Bölgelerde organizmalar arasındaki HW ye bağlı ortalama heterozigotluk.

l       HT; İnceleme yapılan tüm alandaki organizmalar arasındaki HW ye bağlı ortalama heterozigotluk

Alt gruplar arasındaki genetik farklılık/ uzaklaşma ölçülebilir:

Wright İstatistikleri

Wright’ın “Fiksasyon İndeksi” (F İndeksi) bir populasyonun herhangi bir hiyerarşik seviyesinde rastgele eşleşme sonucu heterozigotluktaki azalmayı göstermektedir. Genetik farklılaşmayı saptamak açısından bu indeksler önemlidir çünkü farklı organizmalar arasında alel frekanslarına gerek duyulmaksızın heterozigotluk seviyelerine bakılarak tüm populasyon üzerinde gruplaşmanın etkisi saptanabilir.

·          F_SR=         H_R-H_S / H_R      =  0.1589 - 0.1424 / 0.1589

                                                                 

F_SR = sub/alt popülasyonlarda heterozigotluğun değişiminin bölgesel popülasyona göre ifadesi

H_R = bölgesel heterozigotların ortalaması

H_S = sub popülasyonun heterozigotlarının ortalaması

·        F_RT   =    H_T -H_{R /} H_T   =  0.2371 - 0.1589/ 0.2371

                                                                 

F_RT = bölgesel popülasyonlarda heterozigotluğun değişiminin toplam popülasyona göre ifadesi

H_R = bölgesel popülasyonda heterozigotların ortalaması

H_T = toplam popülasyonun heterozigotlarının ortalaması

·        F_ST =      H_T –H_{S   /} H_T     =     0.2371-0.1424 / 0.2371 =      0.3993

                                 

F_ST = alt popülasyonlarda heterozigotluğun değişiminin toplam popülasyona göre ifadesi

H_R = bölgesel popülasyonda heterozigotların ortalaması

H_T = toplam popülasyonun heterozigotlarının ortalaması

FST indeksi hiyerarşinin en düşük ve en yüksek populasyon seviyelerini karşılaştırır ve tüm etkileri verir.

Örnekte verilen değerler yeine koyulduğunda F_ST = 0.39932 ‘dir. Örnekteki ortalama heterozigotluktaki tüm azalma, sonuç olarak (0.3993) %40’a yakındır.

FST;

l      0 ile 0.05 arasında ise altpop. arasındaki farklılık düşük düzeydedir.

l      0.05 ile 0.15 arasında ise farklılaşma orta derecede,

l      0.15 ile 0.25 arasında ise genetik çeşitlenme yüksek düzeyde, 

l      0.25 in üstündeki değerleri alıyor ise çok büyük genetik farklılaşma vardır.

Fst ‘yi etkileyen etmenler:

·        popülasyon boyut= Fst matametiksel bir ifadedir. Bu nedenle popülasyonun boyutu işlemi etkilediğinden genetik değişmeyi de etkiler.

·        Seleksiyon=

·        Göç = gen akışına sebep olduğundan etki eder. Bireylerin altpopulasyonlar arasında hareket etmesi alel frekansları  üzerinde mutasyondan daha büyük bir değişim yaratabilmektedir. Çok genel olarak bir altpopulasyona her generasyon katılan organizmaların oranını Nm olarak ifade ederiz. (N= populasyonun boyutu, m=göç oranını)

Nm = Göçle popülasyona giren bireyin sayısı

Göç populasyon altyapılanmasında önemli bir harekettir ve Fst ile ilişkilidir.

                               F_ST   =        1/ 1+4Nm

                                            

Eğer altpopulasyon tamamen birbirinden izole olmuşsa Nm=0 ve F_ST=1 olarak ifade edilebilir.

·        Sonuç: göç arttıkça genetik uzaklaşma azalır. Alt popülasyonların genetik benzerliği artar. Dolayısıyla, göç altpopulasyonlar arasındaki genetik uzaklaşmayı önleyen en önemli potansiyel güçlerden biridir.

.

·        Ayrılmanın kırılması- Wahlund etkisi

Eğer populasyon alt yapılanması önlenir ve önceki altpopulasyonlar rastgele eşleşmeye devam ederse, ortalama homozigotlukluk azalır ve heterozigotluk eşit düzeyde artar. Altpopulasyonların birleşmesi sonucu ortalama homozigotluğun azalması fenomeni “ayrılmanın kırılması” veya “Wahlund prensibi” olarak bilinmektedir.

Wahlund etkisinin genetik yapıdaki önemi

  Altpopulasyonların birleşmesi bu gruplarda sık görülen homozigot resesif alelin yol açtığı genetik hastalığı taşıyan çocukların doğma şansını azaltır. Çünkü homozigotluk azalır.

Göç ve Gen Akışı

Populasyonların alt gruplara ayrılması bir süre sonra rastgele eşleşme göstermeyen (homojen) grupların oluşmasına yol açar.

Bireylerin alt populasyonlar arasında hareket etmesine –göç- (migrasyon) ve bu şekilde bir altpopulasyona yeni genlerin girmesine  “gen akışı” denir. Bu durum genetik çeşitliliğe yol açan bir mekanizmadır.

Genler, göç eden bireyler tarafından (hayvanlar, tohumlar, sporlar vs) yada gametler tarafından (örn. Polenler ve sucul hayvanların gametleriyle) altpopulasyonlar arasında taşınabilir. Yeni bir altgruba girdiği halde üreme başarısı göstermeyen bireyler gen akışına katkı sağlamaz.

Gen akışının toplulukları “homojenize” edici  etkisi:

Altgruplara ayrılmış populasyonlarda kendi içinde üreme sonucu uzun zamanda  homozigotlaşma meydana gelir. Göç yoluyla bu dengede tutulabilir. Buna homojenize edici etki denir. Yani gen akışı ile genetik farklılaşma ortadan kaldırılır.

Ada Modeli Gen Akışı

Anakaradan adaya göç sonucu belli bir generasyonda beklenen gen frekansları:

                             p_t= p* + (1-m)^t(p_o – p*)

                                   Ada modelinde

                                   p_t=p_t-1(1-m)+p’m

                                              yada:

                                    p_t = p + (1-m)_t(p₀-p)

p_t  = A’nın ada altpopulasyonunda herhangi bir generasyondaki (t) frekansı

m = Herhangi bir generasyonda ada altpopulasyonu ile anakara populasyonu arasında rastgele eşleşme sonucu oluşan zigotların frekansı ( aynı zamanda tek bir generasyondaki “göç” oranınıdır

Anakara’daki A ve a nın frekansları p* ve q* ; adadakiler p ve q’dür

TÜR

Ayırd edici özelliklere sahip alt populasyondur. Alt-popülasyonlar arasında ayırdedici

özellikler genetik drift ya da doğal seleksiyonla sabitlenmiştir.

       TÜR NEDİR?

•         Biyolojik: Türler gerçekte yada potansiyel olarak birbirleriyle çiftleşerek üreyen doğal populasyon gruplarıdır. Diğer gruplardan üreme ile izole olmuşlardır.

•         Evrimsel: Tür populasyonların yada canlıların oluşturduğu tek bir soy hattıdır; benzer soyhatlarından ayrımını korur, kendi evrimsel eğilimlerine ve tarihsel sonuna sahiptir.

•         Filogenetik: (1)Canlıların oluşturduğu indirgenemez bir kümedir ve benzeri kümelerden açık biçimde farklıdır; her tür içinde bir ata ve ondan türeyenler gözlenir; (2) Bir tür ortak ataya sahip olan en küçük tek kökenli gruptur.