Özet
Farklılaşmış hücreler, embriyonik kök hücreyle füzyonu sonucu heterokaryon oluşumu ile yeniden yapılandırılabilir. Bu makalede şu kanıtlanmak istenmiştir: B lenfositlerinin multipotent hale dönüşümü daha önce düşünülenin aksine nükleer füzyon ve hücre bölünmesinden önce oluşan geçici heterokaryon kullanımı ile daha hızlı gerçekleşir. İlginç olanı ise, yeniden yapılandırılmış B lenfosit hücrelerinde insan kök hücrelerine özgü genlerin ( İSSEA4, İFGF reseptör ve ligandları) anlatımı yapılırken fare kök hücrelerine özgü genlerin (örn; Bmp4 ve LIF reseptörleri) anlatımı yapılmamasıdır. Genetik olarak yapılandırılmış fare kök hücrelerinin kullanımıyla şu kanıtlanmak istenmiştir: indüklenmiş pluripotent hücre için gerekli olduğu düşünülen Sox2'den bağımsız olarak insan lenfosit hücrelerinde başarılı bir yeniden düzenlenme yapılabilir. İleriki aşamalarda gereksinim duyulmamasının aksine başlangıçta Oct4'e belirgin şekilde ihtiyaç duyulur. Farklılaşmanın başlaması ile birlikte Oct4 sentezi de azalır. Bu nedenle deneysel heterokaryonlar, yeniden programlanmış insan hücrelerinin multipotent hale gelmesi için gerekli özgün faktörlerin izlenmesine olanak verir.
Kök hücre özelliği kazandırılmak için yeniden yapılandırılan somatik hücreler çoğaltılabilir ve doku naklinde hastaya özgü kök hücreler gibi kullanılabilir. Bu nedenle bu hücreler, hücre terapilerinde önemli bir çalışma alanıdır. Epigenetik düzenlenme, nüklear transfer ya da bir ve ya birden fazla transkripsiyon faktörünün ekspresyonunun sağlanması gibi birçok farklı yollarla gerçekleştirilebilir. Her ne kadar kök hücrelere göre daha düşük düzeyde de olsa; Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 transkripsiyon faktörlerinin retroviral aracılı ekspresyonları, fibroblastların kök hücreye dönüşümünü kontrol ettiği görülmüştür. Ayrıca; yeniden yapılandırılmış insan fibroblastlarında Oct4 ve Sox2'nin kullanımı ile Nanog+Lİn28 ya da Klf4+c-Myc2’nin kullanımında paralellik gözlemlenmiştir. Bu ön çalışmalar, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPS) için gerekli birkaç faktörü ortaya koymuş ve verimli pluripotensi dönüşümü için bunlardan birinin olması gerektiğini ortaya çıkarmıştır. Yeniden yapılandırma bunların yanında hücre füzyon yöntemi ile de yapılabilir. Örneğin; pluripotent bir hücreyle, embriyonik karsinoma hücreleriyle ya da embriyonik germ hücreleriyle füzyonu sonucunda, farklılaşmış bir hücrenin somatik kromozomlarında pluripotensiyle ilişkili genlerin aktivasyonu sağlanır. Farklılaşmış hücrede genlerin epigenetik olarak düzenlenmesiyle yapılan hücre yapılandırılması, nuklear füzyon ve genom duplikasyonuna yüzde yüz gerekli olup olmadığını kesin olarak göstermemektedir. Burada B hücrelerinin yeniden programlanması için fare embriyonik kök hücreleri(fEK)’yle füzyonunun zorunlu olup olmadığını araştırılmış ve B Lenfosit ve kök hücre nukleusları tarafından oluşturulmuş heterokaryonda yeniden yapılanma olduğu ve tekrarlandığı gözlenmiştir. Ayrıca B hücrelerinin kök hücre gibi başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması için Oct4 gerek duyulurken Sox2’ye gerek duyulmadığı gösterilmiştir. Burada elde edilen datalar insan hücrelerinin pluripotensi için düzenlenmesinde gerekli faktörlerin belirlenmesinde alternatif bir yol oluşturabilir.
SONUÇ
Nuklear Füzyon Sonrası Heterokaryonda Yeniden Yapılandırma Genlerinin Ekspresyonunun Başlatılması
Polietilenglikol(PEG) kullanılarak insan B hücreleri(hB) ve fare Embriyonik Kök hücreleri (fEK) füzyona uğratılmış ve füzyon sırasındaki nüklear olaylar flüoresan mikroskopunda ve RT-PCR’da gen ekspresyon analizleri ile gözlemlenmiştir. Füzyon hücrelerinin ayırt edilebilmesi için E14tg2 fare embriyonik kök hücreleri DiD ve insan B hücreleri DiI ile işaretlenmiştir. İkisi ile işaretlenen heterokaryon hücreler (heterokaryonlar) ise FACS ile ayrılmışlardır. Hücre füzyonunu takip eden 2. gün füzyon hücrelerinin % 98-99’u iki marker ile işaretlenmiş bir insan ve bir fare nükleusu içeren ve heterokaryon olarak adlandırılan hücreleri vermiştir. Nüklear füzyon ayrıca insan kromozomuna özgü (α-satellite, yeşil) ve fare kromozomuna özgü ( γ- satellit, kırmızı) probların kullanılmasıyla flüoresan insitu hibridizasyon (FISH) yöntemi ile de gözlemlenmiştir.
B lenfosit kaynaklı nükleusta pluripotensi ve lenfosit ilişkili genlerin ekspresyonları qRT-PCR’da gözlenmiş ve füzyondan hemen hemen 1 gün sonra insan Oct4, Nanog, Cripto, Dnmt3b ve Tle1 genlerinin ve 2 gün sonra insan Rex1 genlerinin ekspresyonları gerçekleşmiştir. Heterokaryonda seviyeleri düşük olmasına rağmen (incelenen insan hücrelerinin %1’inde), zamanla miktarları artmıştır. Fakat füzyon yapmamış ya da kendi kendine füzyona uğramış insan ve fare hücrelerinde gözlenmemişlerdir. Tüm aşamalarda iHprt ekspresyonu eşdeğer olarak gerçekleşirken tahmin edildiği gibi iTert ekspresyonu 4. günden itibaren gözlenmiştir. 8 günlük periyot sürecinde heterokaryonda fare lenfositlerine özgü gen transkriptleri gözlenmemiş fakat ikinci gün insan B lenfositlerine özgü genler olan iCD45, iCD37 veihCD19 genleri ile üçüncü gün iCD20 ve iPax5 genlerinin anlatımlarında azalma, insan pluripotensi ilişkili genlerin anlatımında artış gözlenmiştir. Tüm bu veriler, yeniden yapılandırmada doku spesifik genlerin aktivasyonunun ya da inaktivasyonunun heterokaryonda nükleus füzyonu ve hücre bölünmesi olmadan ve bunlara gerek duyulmadan başladığını göstermektedir. Ek olarak, gen ekspresyonun sonuçları populasyon düzeyinde test edildiğinden buyana, heterokaryon ve hibrit hücreler arasında gen ekspresyonu bakımından farklılık olması mümkündür. Oct4 ve kontrol olarak Igf2/H19 impirintlenme noklalarının (ICR) metilasyonlarındaki değişiklikleri incelenmiş ve füzyon hücresi insan B lenfosit hücrelerinde iOct4 promotörleri boyunca ve Igf2/H19 allelerinde çapraz olarak metilasyon olduğu görülmüştür. İnsan kök hücre hattı H1’de karakteristik özelliği olan hipometilasyona benzer, hücre füzyonu ile insan lenfosit hücrelerinde de metilasyonda azalma gözlenmiştir. Lokusların ekspresyon öncesi düzenlenmesiyle tutarlı olarak, nüklear füzyon ve hücre bölünmesi öncesi heterokaryonda iOct4 promotörlerinin demetilasyonu gerçekleşirken, Igf2/H19 ICR’lerinde DNA metilasyonunda bir değişiklik olmadığı ve imprintli durumlarını sürdürdüğü gösterilmiştir.
İnsan Kök Hücre’ye Özgü Genlerin Ekspresyonlarının İndüklenmesi
Yeniden yapılandırılmış insan B hücrelerinde gen ekspresyonu bir kaç insan kök hücre hatları (NCL1 , HI, H7, H9) ile benzerlik göstermektedir. Tüm insan ve fare kök hücreleri hattında Oct4 ekspresyonu bolca yapılır. Nanog ve Cripto ekspresyonları, Oct4’e göre incelenen her bir fare embriyonik kök hücresinde (OS25,CCE, E14, ZHBTc4) tutarlı olarak daha az (100-1000 kat kadar) olmaktadır. Fakat insan hücreleri hattında ve insan B lenfosit hücrelerinde Oct4’le birlikte Nanog ve Cripto’nun ekspresyonu da bol miktarda yapılmaktadır. Sox2 gibi bazı pluripotensi ilişkili genlerin ekspresyonları değişkendir ve genellikle tespitleri için uzun bir zaman geçmesi gerekir (8 günden daha fazla). Bu da Sox2’ nin B hücrelerinde DNA ve histon metilastonunu kapsayan modifikasyonlar ile geç replikasyon için gerekli bir öğe olduğunu gösterebilir. İnsan embriyonik kök hücre (iEK) hatları ile insan B lenfosit-fare embriyonik kök hücre füzyonu (iB x fES)’ndaki gen ekspresyonu benzerlikleri, sadece insan hücresi tarafından yapılan fibroblast büyüme faktörü reseptörü (Fgfr1 ve Fgfr2 ve bir glikoprotein olan hücre yüzey reseptörü SSEA4 ya da sadece fare hücreleri tarafından ekspresyonları olan genleri (Bmp4) ve lösemi inhibitör faktörlerini (Lif) araştırmaya yönlendirdi. Yapılan araştırmalar yeniden yapılandırılmış hücrede iFgfr1, iFgfr2 ve iFgf2 genlerinin anlatımı olurken iBmp4 ya da iLifr ekspresyonu olmadığını göstermiştir. Bu bilgi şunu ifade eder: fare embriyonik kök hücrelerinin kullanılmasıyla gerçekleştirilen yeniden yapılandırılmış heterokaryon ve hibrit hücreler insan hücrelerine fare hücrelerinden daha benzer bir profil gösterir. Bununla uyumlu olarak füzyon hücrelerinin %13-16’sında SSEA4 ekspresyonu gözlenmiştir. SSEA4 bakımından pozitif işaretli hücreler başarı ile füzyona uğramış yeniden düzenlenmiş hücrelerdir ve iOct4, iNanog ve iCripto genlerinin ekspresyonlarını yaparken SSEA4 bakımından negatif işaretli hücrelerde bu genlerin ekspresyonları olmaz ve yeniden düzenlenmeleri gerçekleşmez. Yeniden yapılandırılması başarıyla gerçekleştirilmiş heterokaryon, belki iOct4 metilasyonuna ve SSEA4 ekspresyonuna bakılarak, yeniden yapılandırılmış insan hücrelerinde pluripotensi faktörlerini kodlayan transkriptlerin iEK hücre hatlarına göre neden daha az olduğunu açıklayabilir. fEK hücreleriyle yeniden yapılandırılan insan B lenfosit hücrelerinin çoklu hücre soylarını verip vermeyeceğini araştırmak için, iB x fEK kültürü hücre füzyonundan 6-8 gün sonra farklılaşmayı uyarmak amacıyla Retinoik Asit (RA) ile muamele edilmiştir. RA ile muameleden önce birçok iB x fEK kolonileri alkalin fosfataz (AP) aktivitesi göstermiş ve insan AP transkriptlerinin ekspresyonlarını gerçekleştirmiştir. Hibrit kolonileri aynı zamanda pluripotensi marker genlerinin (iNanog proteini) ve insan embriyonik spesifik antigenlerinin (SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81) de ekspresyonunu yapmıştır. RA ile muamelenin ardından, koloniler arasında morfojenik heterojenite artarken, AP aktivitesi ve iOct4, iNanog ve iRex1 genlerinin ekspresyonunda azalma olmuştur. iB x fEK hücrelerinde AP ile indüklenmiş ekstra embriyonik (iCdx2, iHand1 ve iGata6), endoderm (iSox7, iHnf4 ve iCollagenIVaI) ve ektoderm (iMixl1, iEbf ve iMyoD) farklılaşması gözlenirken, kontrol insan B hücrelerinde gözlenmemiştir. Ayrıca farklılaşma, farklılaşmış insan hücrelerine benzer şekilde iOct4 promotörünün metilasyonu ile sonuçlanır. Tüm bu çalışmalar göstermiştir ki; fare embriyonik hücresiyle yeniden düzenlenmiş insan B hücresinde genlerin ekspresyonları düzenlenir ve çoklu hücre soylarına farklılaşma gözlenir.
İnsan B Hücrelerinin Türler Arası Yeniden Yapılandırılmaları fOct4’ye İhtiyaç Duyarken fSox2’e Gerek Duymaz.
Oct4, embriyonik kök hücrede düzenlenme sisteminin temel bir parçasıdır ve kendini yenilemesi ve pluripotensi için esansiyeldir. Türler arası heterokaryonda fOct4’ün ( fare kaynaklı Oct4) potensiyelini gözlemlemek için Flag İşaretli fare embriyonik kök hücreleri oluşturulmuş ve insan B lenfositleriyle füzyona uğratılmıştır. Hücre füzyonundan 3- 6 saat sonra fare EK kaynaklı Flag işaretli Oct4’lerin insan nükleuslarında toplandığı görülmüştür. Ayrıca iOct4 transkripsiyonu başlamadan önce (24 saat) Oct4 proteinleri heterokaryon nükleusunda bulunduğu gözlenmiştir (3saat sonra). Böylece insan lenfosit hücrelerinde yeniden yapılanma daha olmamışken EK kaynaklı Oct4 translasyonu gerçekleşir. İnsan fibroblast hücrelerinin EK benzeri hücrelerine dönüşümleri en az dört faktöre (Oct4, Sox2, Nanog ile birlikte Lin28 ya da Klf4 ile birlikte c-Myc) ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Sox2 içermeyen fare EK son zamanlarda göstermiştir ki; Oct4’ün yüksek miktarlarının sağladığı pluripotensi, ekstra embriyonik farklılaşmanın durdurulması için büyük önem taşıyan Sox2 tarafından engellenebilir. Yeniden yapılandırmada Sox2 ile Oct4 arasındaki önem ilişkisini incelmek için insan B hücrelerine füzyon partneri olarak Sox2 ya da Oct4 için indüklenmeleri engellenmiş (tet-off) fare embriyonik kök hücreleri kullanılmıştır. Bu fEK hücre hatlarının Doxycycline (+Dox) ile muamelesi sonucuda hemen ve hızlı bir şekilde Oct4 ya da Sox2 gen/protinlerin ekspresyonları ortadan kaldırılır. ZHBTc4 ( endojen Oct4 geni Dox ile downregüle edilebilen Oct4βgeo transgeni ile değiştirilmiş fare EK hücreleri)’n Dox ile 6-12 saat için ön muamelesi diğer pluripotensi ilişkili genlerin ekspresyonlarına ya da B hücreleriyle füzyon yapma yeteneğine önemli bir etki yapmadan fOct4'ün kademeli olarak azalması ile sonuçlanır. Başarlı bir yeniden yapılanma için gerekli bir kaç insan geni ZHBTc4 hücrelerinin Dox ile ön muamelesi sonucunda (6 saat sonrasında) azalırlar ya da yok edilirler (12 saat sonra). Aynı şekilde fOct4’lerin siRNA (short interference RNA)’lar ile yok edilmesi de E14tg2a fare EK hücrelerinin yeniden programlanmasını engeller. Bu bilgiler başarılı bir yeniden yapılanma için Oct4’ün kritik bir önemde olduğunu doğrular. İnsan lenfositlerine özgü genlerinin yok edilmesi hiçbir şekilde Oct4’ün ortadan kaldırılmasıyla etkisiz hale getirilemez. Bu sonuç belki, heterokaryonda ileride gerçekleşen gen ekspresyonlarının aktive edildiğine ve susturulduğuna kanıt olabilir.
Endojen Sox2 geni Dox ile downregüle edilebilen Sox2Zeo transgeni ile değiştirilmiş 2TS22C fEK hücrelerinde Sox2 ekspresyonunun engellenmesi ise Oct4’ün aksine yeniden yapılanmayı çok az etkiler. Ayrıca 2TS22C fare EK hücreleri 2O1 (Sox2 bakımından eksik) hücreleriyle füzyona uğratıldığında yeniden yapılanma kusursuz bir şekilde gerçekleşmektedir. Bu veriler yeniden yapılanma için Oct4’ün gerekli olduğunu Sox2’nin gerekli olmadığını göstermektedir. Ayrıca 2O1 ile füzyona uğratılmış 2TS22C hücrelerinde iSox2’nin indüklendiği gözlenmiştir. Bu da fOct4 miktarındaki artışın somatik nükleusta Sox2’in ekspresyonunu indüklediği fikrini akla getirir.
Embriyonik Kök Hücre Kökenli Oct4 Hücrenin Yeniden Yapılanmış Durumunu Devam Ettirmesi İçin Gerekli Değildir
Yeniden yapılanmış hücreler gen ekspresyonlarını bağımsız olarak sürdürebilirler mi yoksa fare EK hücrelerinin sağladıkları devam ettirici faktörlere mi gerek duyduğunu araştırmak için lenfosit ve bilinçli olarak Oct4 anlatımının baskılandığı EK hücre (ZHBTc4) ile hibritlenmiştir. Bu şekilde, başarılı bir yeniden yapılanma gerçekleştirmiş füzyon hücrelerinin 10 gün sonunda GFP sentezinin yeniden başlamasının temeli araştırılmıştır. Beklendiği gibi hibrit hücreler ZHBTc4 kaynaklı Oct4βgeo ve bazı pluripotensi ilişkili genlerin ekspresyonlarını gerçekleştirirken B hücresine özgü CD19, Pax5 ve Ly108 gibi genlerin ekspresyonlarını gerçekleştirmemiştir. Hibrit hücreler Dox ile muamele edilmiş ve ZHBTc4 kaynaklı Oct4βgeo transkriptlerinin downregülasyonu gerçekleştirilmiştir. ZHBTc4 kaynaklı Oct4’ün geri çekilmesi, yeniden yapılandırılmış hücrede iNanog ve iSox2 genlerinin ekspresyonlarını değiştirmemiş, trofektoderme farklılaşmasını hızlandırmamış ya da embriyonik marker olan fCdx2 ve fHand1’in ekspresyonlarını arttırmamıştır. Kısacası parental ZHBTc4 hücre hatları tarafından indüklenen olayları değiştirmemiştir. Yapılan bu çalışma gösterir ki; lenfositlerin fare EK hücreleri ile yeniden programlanması, lenfosit nükleusunda epigenetik (ve kalıtsal ) olarak genlerin düzenlenmelerini indükler.
TARTIŞMA
Bu çalışmada fare embriyonik kök hücrelerinin insan lenfositleri için füzyon partneri olarak kullanılmasıyla, yeniden yapılandırılabileceği, normalde insan blastosist ve insan EK hücre hattı gelişimi ile ilgili endojen genlerin yeniden düzenlenip ekspresyonlarının sağlanabileceği gösterilmiştir. Türler arası gerçekleştirilen başarılı yeniden yapılanma, heterokaryonda kromozomların rekombinasyonlarını ve insan FGF sinyal yolu bileşenleri ile SSEA4, TRA-1-60 ve TRA1-81 gibi insan EK hücreye özgü yüzey moleküllerin ekspresyonlarını başlamasını kontrol eder. Fare EK hücrelerinin yeniden programlanma kapasitelerinin Oct4 delesyonu ile durdurulmasına kadar yeniden programlanmanın Oct4'e bağımlı olarak gerçekleştiği gösterilmiştir. İnsan B lenfositlerinin EK hücre benzeri dönüşümleri sonucu iOct4 lokusunda DNA metilasyonunun kaybı ile somatik genomda yeniden modellenmeyle sonuçlanır. Önemli olanı ise, yeniden programlanma bir kez dominant nukleus (EK hücre nukleusu) tarafından sentezlenen faktörler tarafından başlatıldıktan sonra Oct4’den bağımsız olarak gerçekleştiği, Oct4’ün engellenmesinin hibrit hücrede fenotipe yansımaması ile gösterilmiş olması.
Bu çalışmaların hepsi yeniden programlanmanın bir kere başlatıldıktan sonra kendiliğinden devam ettiğini ve kalıtsal olduğunu gösterir. Burada gösterilen yeniden yapılandırma verilerinin bir şaşırtıcı yönü de, heterokaryon içinde hızlı bir gen dönüşümü ve DNA demetilasyonunun gerçekleşmesidir. Başarılı bir yeniden yapılandırma heterokaryonlarda belirli bir kısmında (>%13) meydana geldiği gibi, muhtemelen lenfositlerin dönüşümü için DNA’nın kısmi replikasyonuna (DNA tamiri) ihtiyaç duyulur. Daha önce yapılan çalışmalar, farklı hücre hatlarından elde edilmiş yetişkin hücrelerin kullanıldığı deneysel heterokaryonlarda genom duplikasyonu ve hücre bölünmesi olmadan yeniden programlanabileceği gösterilmiş, burada da unipotent lenfositlerin multipotent hücreye dönüşümünün geçici heterokaryonda yine hücre bölünmesi olmadan gerçekleşebileceği gösterilmiştir. İnsan Oct4 ve Nanog genlerinin insan nukleusunda yeniden aktivitesi DNA demetilasyonu ile sağlanmıştır. İnsan Oct4 ve Nanog’ların Xenopus oositleri ile yeniden aktivitesi, DNA’nın hızlı bir şekilde demetilasyonu ve Tpt1 aktivasyonu ile sonuçlanmıştır. Türler arası heterokaryonda endojen pluripotensi ilişkili genlerin hızlı bir şekilde yeniden aktivasyonu, MEFs yada NSCs ile füzyona uğratılmış fare EK hücreleri tarafından ekspresyonu olan Oct4gfp ile yapılan çalışmalarla tutarlıdır. İnsan somatik hücrelerinde fare EK hücrelerinim dominant bir şekilde çoklu hücre hatlarını verebilme potansiyelini yok ettiği ipatlanmıştır. Bu nedenle, heterokaryondan fare kromozomlarının çıkartılma çalışmaları, insan kök hücrenin kontrolü için uygulanabilir ve multipotent yapılandırmada kritik olduğu düşünülen proteinlerin rollerinin ayrıntılı olarak incelenmesi için alternatif olarak fare EK hürelerinin kullanılması, soy hatlarının verebilecek potensiyeli yeniden oluşturmak için farklı protein karışımlarının kullanılmasına mantıklı bir açıklama getirebilir.
Burada yapılan deneylerle gösterilmiştir ki; yeniden yapılandırılmış insan hücreleri fare EK hücrelerinden farklı ve insan EK hücrelerine özgü olan transkriptlerini, sinyal moleküllerini ve hücre yüzey antijenlerini sentezler. Bu da, insan nükleusunda erken embriyonik genlerinin ekspresyonlarının trans-etkili (fareye ait) faktörlerle başlatılabileceğini akla getirir. Fare EK hücre nükleusu ile insan yeniden yapılandırılmış hücre nükleusu arasındaki ekspresyon farkı, muhtemelen insan ve fare genomları arasındaki cis- etkili bölgelerin bölgesel farklılıklarını yansıtır. Fareye sokulmuş iTert geni ile yapılan tüm çalışmalarda insandaki endojen iTert ekspresyonuyla benzer olarak fTert'den daha çok iTert'in ekspresyonu gözlenmesi de bu fikre destek olmuştur. İnsan lenfositlerinin fare EK hücreleri ile füzyonu sonrasında, insan EK hücre benzeri hücrelerin FGF sinyal bileşenleri tarafından kontrol edildiği ve Lif/Bmp’den bağımsız olduğu gösterilmiştir. Bu veriler; insan ile fare EK hücreleri arasındaki iyi tanımlanmış farklılıkların, kök hücrelerin embriyogenez sırasında ne zaman ve nereden izole edildiğinden çok, farklı sinyalizasyon ve transkripsiyonel ağları yansıttığını gösterir.
Burada yapılan çalışmalarla Oct4’ün aksine Sox2’nin lenfositlerin multipotent hale dönüşümü için gerekli olmadığı gösterilmiştir. Bu gözlem fare ve insan fibroblastları, fare hepatositleri, mide hücreleri ve fare B lenfositleriyle daha önce yapılan yeniden yapılandırma çalışmalarıyla tezat oluşturur. Bunun nedeninin iPS de kullanılan transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarındaki farklılıklarından mı yoksa yeniden yapılanma uzun bir zaman sürecinde meydana geldiğinden (örneğin; Oct4, Nanog ve Sox2 gibi pluripotensi ilişkili genler transdüksiyondan 2 hafta sonra aktive olurlar) dolayı mı olduğu bilinmiyor. Fakat son zamanlarda fare EK hücrelerinde Oct-Sox enhancerlerinin aktivasyonu için Sox2'nin vazgeçilebilir olduğu gösterilmiştir. Hatta Sox4,Sox11 ve Sox15 gibi Sox aile üyelerinin eklenmesi de yeniden programlanma için gereksiz olabilir. İlginç şekilde, Sox2 eksik EK hücrelerde ( EK 2O1) Oct4 enhancerlarının miktarı ile yeniden yapılanmış insan B hücresinde iSox'nin ekspresyopnundaki artış gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan genom çalışmalarında hem insanda hem farede Sox2'nin Oct4 için direkt hedef olduğu gösterilmiştir. Bu da iSox2'nin neden yüksek Oct4 aktivitesi olan fare EK hücresinin kullanılması ile etkin bir yeniden yapılanmaya sebep olduğunu açıklayabilir. Kontrol altında gerçekleştirilen lenfositlerde ekzojen Oct4'ün overekspresyonu pluripotent dönüşümü başlatmaz. Bunu başlatan, kromatin yeniden düzenlenme faktörlerinin eklenmesi, kritik olan Oct4’ü etkinleştirilmesi ya da DNA'nın demetilasyonunun sağlanması olduğu düşünülmektedir. Kısacası, türler arası heterokaryon iPS için ilginç ve ücretsiz bir yaklaşım oluşturmakta ve pluripotensinin indüklenmesi için gerekli faktörlerin ayrı ayrı ve birlikte incelenmesine izin vermektedir.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder